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1、第五章细菌毒素 细菌毒素 是一类特殊的细菌代谢产物 在宿主体内能选择性与靶细胞膜上相应受体结合 然后作用于特定靶点 直接或间接导致靶细胞功能异常或损伤 甚至死亡 引起宿主出现相应病理反应 G G cellwall 根据细菌细胞壁的构造和化学组成不同 可将其分为G G G 细菌的细胞壁较厚 20 80nm 但化学组成比较单一 只有90 的肽聚糖和10 的磷壁酸 G 细菌的细胞壁较薄 10 15nm 却又多层构造 肽聚糖脂多糖层等 其化学成分中除含有肽聚糖以外 还含有一定量的类脂质和蛋白质等成分 一根据毒素分子性质与结构分类多糖毒素细菌的非蛋白产物有核酸 脂类和多糖等 但只有脂多糖 lipopol
2、ysaccharide LPS 被一致公认为细菌毒素 即内毒素 LPS是G 细胞壁的主要成分之一 在细菌存活时 LPS只是细胞壁的结构成分和菌体抗原 只有当细菌死亡裂解 LPS游离后才作为毒素起作用 蛋白毒素又称外毒素 依据肽链结构可分 1A B型毒素2单肽链毒素3小分子多肽毒素 二外毒素 exotoxin 1概念细菌生长过程中产生和分泌到细菌细胞外的毒性蛋白质 2特点1 由细菌产生的非结构蛋白质成分2 高毒性3 良好的抗原性4 特异性5 不稳定 1 本质为蛋白质 一般是可溶的蛋白质 典型的外毒素A B模式A亚单位 决定毒性B亚单位 结合活性部分 与靶细胞上受体结合 无毒性 2 高毒性通常只有
3、毒性菌株才能产生毒素 而非毒性菌株不能产生毒素外毒素是毒力因子的主要决定因素外毒素的毒性通常非常强3 良好的抗原性类毒素 Toxoids 由于变性或化学修饰而失去毒性的毒素 但仍保留其抗原性 抗毒素是一种含有抗体的血清制品 它是把类毒素给马注射 使其产生大量抗体 然后采取马血清 将其精制浓缩而成 治疗作用 4 特异性 选择性强高度生物活性 类似酶催化的作用方式对底物具有高度选择性作用模式高度专一只攻击特定的细胞损伤位点显示毒素作用位点5 不稳定 对热 酸和蛋白酶敏感 3来源 产生外毒素的细菌主要为G 菌 但越来越多的G 菌也发现能产生外毒素 大多数外毒素为分泌型 少数则存在于细菌细胞内 当细菌
4、裂解后才释放到细胞外 有的为无毒的毒素前体通过肠道内的蛋白酶或细菌产生的酶激活后才具有毒性 4理化及生化特性具有蛋白质的基本特性 温度 化学药品敏感类似于酶的特性 蛋白质 高生物学活性 作用的专一性 5分类 根据毒素作用的器官不同 可分为细胞毒素 肠毒素 神经毒素等细胞毒素 白喉毒素 葡萄球菌表皮剥脱毒素 葡萄球菌毒性休克综合征毒素 A群链球菌致热外毒素肠毒素霍乱肠毒素 ETEC肠毒素 产气荚膜梭菌肠毒素 葡萄球菌肠毒素神经毒素 破伤风痉挛毒素 肉毒毒素 5分类 根据毒素的作用机制 可分为膜损伤 抑制蛋白质合成 激活刺激信使通路 激活免疫应答和蛋白酶等 7外毒素的作用方式 MODEofacti
5、on 1 作用细胞膜Damagesmembranes formspores2 作用于酶Inhibitproteinsynthesis N glycosidase糖苷酶Activate2ndmessengerpathways ADP ribosyltransferase核糖基转移酶Protease Zinc metalloprotease金属蛋白酶3 激发免疫反应 superantigen 二内毒素 endotoxin 概念 G 菌细胞壁脂多糖 菌体崩解时释放 性质稳定 细菌的非蛋白产物有核酸 脂类和多糖等 但只有脂多糖 lipopolysaccharide LPS 被一致公认为细菌毒素 即内毒
6、素 LPS是G 细胞壁的主要成分之一 在细菌存活时 LPS只是细胞壁的结构成分和菌体抗原 只有当细菌死亡裂解 LPS游离后才作为毒素起作用 1来源 G 2化学成分 结构脂多糖 包括 类脂A 核心多糖 特异多糖 3特点 1 低毒性 Causeawidevarietyofseriousreactionssuchasfever shock changesinbloodpressure andinothercirculatoryfunctions 2 弱抗原性 不能产生类毒素 3 特异性不高 EndoxinsaretoxictomostmammalsRegardlessofthebacterialso
7、urce allendotoxinsproducethesamerangeofbiologicaleffectsintheanimalhost发热反应 白细胞反应 内毒素血症与内毒素休克4 相对稳定 耐热Boilingfor30mindoesnotdestabilizeendotoxinCertainpowerfuloxidizingagentssuchassuperoxide peroxideandhypochlorite havebeenreportedtoneutralizethem 4结构 LPS包括 LipidA特殊的糖磷脂 由焦磷酸键联接的氨基葡萄糖聚二糖链 并结合有多种长链脂肪酸
8、 是内毒素的毒性成分 各种G 的LipidA的化学成分和结构虽有差异 但极为相似 无种属特异性 所有G 菌内毒素引起的毒性作用大致相似 非特异性核心多糖外与O抗原相连 内与LipidA相连 O特异性多糖又称O侧链或O抗原多糖低聚糖 3 5个 组成的重复单位 10 40个 重复单位的数量 单糖种类 位置及排列顺序因菌种而异 6内毒素的检测1 制药业静脉注射和皮下注射的药物 医疗器材2 环境监测室内和室外空气质量 水污染3 医学G 细菌的感染败血症等诊断 是指细菌进入血液循环 并在其中生长繁殖 产生毒素而引起的全身性严重感染 7细菌内毒素的检测方法1 生物学检测方法RabbitPyrogentes
9、t热原检查LimulusAmebocyteLysatetest鲎变形细胞溶解物NeutrophilChemiluminescencetest化学荧光法2 非生物学检测方法化学标记物 脂多糖中的脂类 检测能特异性识别脂多糖的分子 热原检查20世纪最经典的方法4小时 从兔子耳朵注射药物 测定兔子体温Thistest whichtookapp 4hrs isaccomplishedbyinjectingthesubstancebeinganalysdintoarabbit sear Iftheanimaldevelopedafever itconformedthepresenceofpyrogens
10、 鲎变形细胞溶解物19世纪70年代商业化 1977FDA批准ToobtainthelysaterequiredfortheLALtest asmallamountofhorseshoecrabs bloodisdrawnNext bloodcellsareseparatedandlysedtoobtainthecellularproteins 其检测原理不十分清楚 一般认为是变形细胞溶解物中的凝固酶原经内毒素激活转化成具有活性的凝固酶 在凝固酶的作用下 变性细胞中的凝固蛋白原转变成凝固蛋白 凝固蛋白相互聚合形成凝胶 内毒素和外毒素基本特性比较 内毒素和外毒素基本特性比较 第二节细菌毒素的作用机
11、制 细菌毒素一般至少有两个功能区 一是靶细胞膜受体结合区 决定毒素对靶细胞的特异性并介导毒素进入细胞 另一个是活性区 它选择 靶点 决定毒力强弱和作用机制 具有膜穿孔或酶活性 并引起相应临床症状 细菌毒素的特定作用对象为 靶点 它可以是某种细胞 细胞器 酶或其他大分子物质 毒素要发挥毒性作用 需经以下步骤 1毒素结合区与敏感细胞的相应膜受体结合 2毒素进入细胞或毒素信号导入细胞 3毒素到达靶点 4毒素激活 修饰或改变靶点 一毒素进入靶细胞的一般机制 一 毒素与靶细胞膜受体结合细菌毒素与靶细胞膜上相应受体结合是发挥毒性作用的第一步 毒素引起宿主何种临床症状 首先取决于细菌的定植部位及毒素受体 毒
12、素受体是一类能与相应毒素特异结合 并能介导毒素 或毒素信号 进入细胞内的膜分子 如蛋白质 糖蛋白 胆固醇等 受体应具有以下特点 1 特异性 受体与毒素有高度对应性 2 高亲和性 受体与毒素结合能力较强 一般是分子空间构象互补吻合 具有不可逆性 当然 也有低亲和性受体 3 效应性 受体能介导毒素内在化 或传递毒素信息 细菌毒素只有1个受体结合区 故1个毒素分子一般只与1个受体分子结合 二 细菌毒素的入胞及转运机制入胞方式细菌毒素与膜受体特异结合后 可通过以下方式进入细胞 1穿膜进入2跨膜控制 具有跨膜控制方式的毒素与膜受体结合后 不进入细胞内 而是通过受体分子构型的改变 引起细胞表面调节装置改变
13、或激活膜内镶嵌的酶分子 将毒素携带的生物信号传递至细胞内 进而调控细胞内的相关代谢反应 3内在化 internalization 是指细菌毒素与相应受体结合后 依靠受体介导的内吞作用 receptormediatedendocytosisi RME 进入细胞 几乎所有的真核细胞膜上都有一种特殊的 内吞细胞器 称为膜小泡 coatedvesicles 二溶细胞机制 一 聚合型穿孔毒素这类毒素至少存在两种聚合方式 1单体分子在靶细胞膜外侧上或在液相中形成聚合体 之后插入细胞膜导致细胞溶解 2一个单体分子先行插入细胞膜内 随后若干个单体分子紧随其后依次插入 排列成中空的跨膜聚合体 导致细胞溶解 二
14、RTX家族分为 1特异性RTX 靶细胞范围广泛 2高特异性RTX 三酶活性机制 许多细菌毒素 如霍乱肠毒素 白喉毒素等等具有酶活 一 ADPR转移酶腺苷二磷酸核糖转移酶的A链一般具有两种酶活性 即尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸糖基水解酶和ADPR转移酶 前者将NAD糖基水解为ADPR和尼克酰胺 后者则将ADPR转移到一个受体分子上 二 葡萄糖基转移酶 三 脱嘌呤酶 四 脱酰胺酶 五 锌内肽酶 六 腺苷环化酶 第四节超抗原 超抗原 superantigen SAg 的概念最早由White于1989年提出 它是一类具有多种免疫活性的蛋白分子 由某些细菌 病毒 支原体等产生 一特点 与普通抗原 conven
15、tionalantigen 相比 细菌毒素超抗原应具有以下显著特点 1只需极低浓度 1 10ng mL 即可刺激强烈的初次免疫应答 可激活的T淋巴细胞的数量比普通抗原多达103 105倍 且没有初次和再次免疫应答的区别 故称为超抗原 而普通抗原必须在体内引导和加强后 才能在体外检测到T细胞增殖反应 2不经抗原提呈细胞 antigenpresentingcells APC 加工处理 可以完整的蛋白分子形式直接与抗原提呈细胞膜上的MHC 类分子及T细胞受体Vb区特异性结合 激活T细胞增殖 而普通抗原则需经APC降解成短肽后 才能提呈于MHC 类分子肽链结合的沟槽内 3结合部位不在抗原肽结合的沟槽内
16、 而在沟槽外侧 具有双结合功能 能同时与APC膜上的MHC a b链及T细胞膜上的TCR b链可变区 Vb 结合 4与TCR结合时 只涉及TCRVb的抗原受体互补决定区CDR2和CDR1 不涉及Vb的CDR3和TCRa的识别 故T细胞对超抗原的反应不受MHC 类分子的限制 这违背MHC限制的 黄金规则 普通抗原特异性细胞反应都受MHC限制 二分类 超抗原 SAg 由某些细菌 病毒和支原体产生 可分为 三诱导免疫应答机制 一 激活MHC表达细胞超抗原不需要抗原提呈细胞的加工处理 但在大多数情况下 依赖于MHC 类分子的提呈 二 激活T细胞SAg与MHC 类分子结合后 由APC提呈直接与TCR Vb连接 由于连接位点在抗原结合沟外侧 因而这一过程不受TCR MHC及CD4 MHC反应的限制 SAg活化T细胞时 不像普通抗原同时受TCRVa Ja和Vb Db Jb多重限制 他们只与TCR Vb结合 由于人TCR Vb的基因只有20余种 而一种SAg一般可选择地与几种TCR Vb分子相互作用 因此 SAg可激活大量的T细胞 即激活T细胞的百分比显著增加 大约占T细胞的10 30 比普通抗原高出
