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1、感染性疾病标志物及快速诊断技术 概述 1 感染性疾病 由某种病原体所致 通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病 主要表现为发热 2 病原体 细菌 含TB 真菌 支原体 衣原体 病毒 原虫等 感染的诊断依据 临床表现 感染的全身中毒症状 畏寒 发热 皮疹等实验室常规检查 血常规 WBC DC影像学检查 X RAY B超病原学检查 染色 培养血清学检查 抗原或抗体检测危重病人 临床表现 WBC DC不典型 感染的分类 按病原学分类 细菌感染 包括结核 真菌感染病毒感染支原体 衣原体按部位分类 局部感染全身感染 临床希望第一时间知道的信息 感染或非感染细菌感染或非细菌感染结核感染或普通细菌
2、感染酵母样真菌感染或丝状真菌感染白色假丝酵母或其他念珠菌感染曲菌感染或毛霉菌感染因为上述感染治疗方法不同 一 免疫学方法 一 降钙素原 降钙素原是正常人血清中存在的含116个氨基酸组成的糖蛋白 最初由甲状腺细胞产生 血清水平很低 在非感染或病毒性感染疾病时保持非常低的血清水平 在细菌性感染时含量升高 并与感染程度和预后呈正相关 PCT含量的变化稳定 并出现在疾病的早期 3 4h 短半衰期 24h 国外把PCT作为最敏感的感染标志 降钙素原PCT 分子结构 血清降钙素 CT 的前肽物质分子量 14 5kDa由116个氨基酸组成的糖蛋白质无激素活性 11号染色体上的单拷贝基因 转录 甲状腺滤泡细胞
3、 降钙素原前体 内源多肽酶 降钙素原PCT 分解 细胞内特殊蛋白酶 正常情况下 降钙素 LinscheidP etalCritCareMed04 32 1715 21Endocrinology03 144 5578 84146 2699 708 在病毒感染时 大量产生的IFN 将会抑制PCT的激活及产生 因此 病毒感染时 PCT的浓度将会保持在较低的水平 BacterialInfection e g Endotoxin IL 6 IL 6 细菌感染后PCT快速升高 KineticsofprocalcitonininiatrogenicsepsisBrunkhorstF Metal Intens
4、CareMed1998 24 888 892 PCT来源 LeftLane 正常组 在不存在感染的情况下 甲状腺外CT表达被抑制 而主要局限于甲状腺和肺的神经内分泌细胞有一定程度的表达RightLane 脓毒症组 在细菌感染时可诱导全身各种组织多种类型细胞CT表达和PCT连续性释放 PCT动力学 2 3h开始增加 6 8h快速升高 12h 48到达峰值 2 3d正常血浆浓度在 0 05ng ml 1000ng ml半衰为15 20h左右 且不受肾功能影响 PCT检测方法 快速半定量法 PCT Q 全自动快速定量法 VIDAS 快速半定量法 PCT Q 样本 200 l血清 血浆结果 30min
5、 同胶体金免疫层析法 即在标准品上结合有胶体金的小鼠单克隆抗降钙素抗体和绵羊多克隆抗降钙素抗体 待检标本加上后 示踪元素即与标本中的PCT结合 形成一个 三明治式 的复合物 然后通过发光比色判断PCT浓度当PCT浓度 0 5 g ml时 夹心复合物呈红色带 颜色深浅与样品中的PCT浓度成正比例 未结合的示踪物扩散到对照区 结合并产生了红色的对照带 全自动快速定量法 酶联荧光法 化学发光法标本要求 静脉抗凝血注意无菌操作 使用新鲜标本 如果4小时内不使用 应将标本放置 20 保存 血浆中的PCT非常稳定 收集标本24h后 PCT浓度在室温下大约下降12 在4 大约下降6 PCT临床意义 细菌感染
6、 脓毒症诊断及严重程度判断脓毒症治疗效果监测及预后评估抗生素的有效管理 细菌感染诊断及严重程度判断 脓毒性休克 严重脓毒症 系统性感染 脓毒症 局部感染 正常值 PCT的浓度随感染的扩散和感染严重程度的加重而升高 脓毒症患者治疗效果及预后监测 n 109 F St ber UniversityBonn LectureatISICEM Brussels2001 通过PCT不断在体内衰减 反映出抗生素治疗策略的成功 随着患者对抗生素治疗的响应 引起了PCT血中浓度水平的典型变化过程 AB antibiotics 抗生素有效管理 PCT的临床应用 急诊住院病房外科手术血液科内科ICU外科ICU儿科急
7、诊儿科病房儿科ICU新生儿科 严重细菌感染或脓毒症的检测 鉴别诊断 疾病或治疗反应的监测局部与全身性感染脓毒症的诊断和监测新生儿脓毒症的检测 生理性一过性峰值创伤后炎症综合症 多发性创伤 大面积烧伤 大手术后 心脏 移植 腹部 使用致炎细胞因子治疗后 OKT3 注射TNF IL 2 抗淋巴细胞球蛋白 某些肿瘤 甲状腺髓样细胞癌 肺小细胞癌和支气管癌 长时间循环衰竭 心源性休克 出血性休克 热休克 PCT水平增加但没有系统细菌感染的几种情况 感染早期 6 12小时后重复检测 亚急性心内膜炎局部感染 细菌感染而PCT不升高的情况 PCT检测影响因素 受以下因素影响 甲状腺功能是功能性甲状腺髓样癌的
8、肿瘤标志物 肾功能严重肾功能受损者中水平较高不受以下因素影响 类固醇药物 自身免疫性疾病 年龄 性別 免疫功能低下状态 肝硬化 HIV感染 二 细菌内毒素 细菌内毒素检测 原理 仪器检测试管内反应物的光密度OD值 取当OD上升到0 02的点的时间作为反应时间 该点在反应曲线上的位置为浊度开始快速变化的时期 该取值能够快速 稳定的获得反应时间 从而判断内毒素的含量 动态浊度法 仪器和试剂 BET 24A细菌内毒素分析仪MB 80微生物快速动态监测系统 标本要求 患者早上尚未进行药物静脉治疗时 MB 80 无热源真空采血管 静脉抗凝血 采血量2 4ml 30min内送检BET 24A 抽取1mL静
9、脉抗凝血 配1mL1号处理液其它体液如脑脊液 胸腹水与血标本要求相同 注意无菌操作 内毒素活性定量检测意义 G 所致脓毒症早期鉴别诊断指导抗生素正确使用判定抗感染治疗效果帮助判断患者的预后 内毒素定量检测的适应症 各种急 慢性病理性发热患者各种类型 中重度感染 肝病 休克 肠道疾病 脏器功能衰竭 大手术术后 患者慢性疾病长期卧床 免疫力低下患者急诊及ICU病房收治的生命体征不稳定的患者 1 1 3 D 葡聚糖 G试验 1 3 D 葡聚糖是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分 以假丝酵母菌属含量最高 而其他微生物动物及人的细胞成分和细胞外液都不含这种成分 因此 血液及无菌体液中检出1 3 D 葡聚糖
10、在很大程度上可以视为IFI的标志 如念珠菌 曲霉 镰刀霉 酵母和丝孢酵母感染等 目前的检测方法为G试验 其原理是1 3 D 葡聚糖有特异性激活鲎变形细胞裂解物中的G因子引起裂解物凝固 故称为G试验 国内已经使用微生物快速动态检测系统检测 标本要求 采样过程要求无菌操作常规病人早上用药治疗前空腹采血取样 血透患者透析前采血 标本类型 抗凝静脉血 使用无热原真空采血管采血量 2 3ml 立即混匀半小时内送检 实验前未打开标本在2 8 可保存5天 打开后标本需在48小时内完成检测 如需长时间储存 存储温度应为 70 血清标本最多可冻融四次 解冻标本检测之前要充分混匀 G试验的临床意义 早期 快速诊断
11、侵袭性真菌感染可用于真菌感染早期筛查 适用于念珠菌 曲霉 肺孢子菌 镰刀菌 地霉 组织胞浆菌和毛孢子菌等 不能用于检测隐球菌和接合菌感染 对真菌感染症状进行诊断 阳性结果代表存在侵袭性真菌感染 三 半乳甘露聚糖 GM 半乳甘露聚糖 GM 是一种对热稳定的水溶性的物质 是广泛存在于曲霉和青霉细胞壁中的一类多糖 一般在曲霉感染者出现临床症状和影像学检查异常前数天 其体内循环中GM即可呈阳性表达 其灵敏度和特异度均可达到80 以上 原理 是一种微孔板双抗体夹心法 采用小鼠单克隆抗体EBA 2 检测人血清中的曲霉菌半乳甘露聚糖 标本要求 标本采集 静脉采血5ml 红帽管 检测标本 血清标本 密封 无菌
12、操作 实验前未打开标本在2 8 可保存5天 打开后标本需在48小时内完成检测 如需长时间储存 存储温度应为 70 血清标本最多可冻融四次 解冻标本检测之前要充分混匀20mg L胆红素 或2g L甘油三酯的脂血 或165mg L血红蛋白的溶血标本不影响检测结果 GM试验临床意义 1 诊断侵袭性真菌感染2 血清GM检测能区分侵袭性肺曲霉感染与白色假丝酵母菌 毛霉 肺炎链球菌感染和烟曲霉口咽定植 但不能区分曲霉菌种 3 评价疗效的可靠指标 G试验和GM试验提高对IFI的诊断 阳性预测值可达100 其它 新生隐球菌 循环夹膜抗原是新生隐球菌病 尤其是新生隐球菌脑膜炎的诊断手段 乳胶法 5min即可出结
13、果 特异性达90 100 可检测35ng ul的抗原ELISA 敏感性高于LA 乳胶凝集 可检测6ng ul 四 结核分枝杆菌的快速诊断 结核病至今仍为重要的传染病 估计世界人口中1 3感染结核分枝杆菌 结核分枝杆菌生长缓慢 一般需2 4周长成肉眼可见的落菌 抗酸染色法是检测TB的传统方法 但存在假阳性因此 快速诊断对TB至关重要 结核感染现状 全球范围内结核病疫情急剧恶化结核病与艾滋病同时流行结核菌耐药现象益发严重人口大规模流动我国是世界上仅低于印度的第二结核病大国结核菌感染率44 5 新发活动性结核患者130万 年死亡13万 年早期快速诊断与治疗成为制约结核病控制的关键常规实验室诊断结核病
14、方法阳性率不到60 全球结核疫情 结核检测方法 一 现有实验室常规检测技术细菌学诊断 涂片 培养免疫学诊断 抗原 抗体胶体金分子生物学诊断 PCR二 其它检测技术结核菌素纯蛋白衍生物PPD TST 实验影像学检查 结核分枝杆菌的快速诊断 结核夹层杯技术 原理 通过专用消化灭活液消化组织细胞和粘蛋白等 将结核杆菌裸露出来 并结合高速震荡 使痰标本充分液化而有利于其中的抗酸杆菌沉淀于特制彭氏杯底部的菌膜上 在夹层杯中直接抗酸染色 干燥 并用取片针顶出内底 经封片等步骤后 镜下检测抗酸杆菌 检测流程示意图 镜下比较 图2 夹层杯法 新方法 菌量多 背景清晰 易于观察 图1 直接涂片法 传统方法 菌量
15、少 背景不清晰 夹层杯诊断技术的优点 阳性率高 背景清晰 易于观察 易于标准化 检测速度快 生物安全性好 夹层杯诊断技术的优点 结核夹层杯技术 标本要求 1 痰液要求新鲜 留取清晨深咳出的第一口痰液 留痰时 患者以清水漱口 次 然后用力咳出气管深处的痰 2 用氢氧化钠处理完全 临床应用 用于结核分枝杆菌的初筛 结核感染T细胞检测技术 是以ELISPOT技术检测结核感染的新方法 ELISPOT是近20年发展起来的检测抗原特异性T细胞的技术 是目前最敏感的检测抗原特异性T细胞的方法之一 干扰素释放实验 IGRA interferon gammareleaseassay 酶联免疫斑点技术 ELISP
16、OT Enzyme LinkedImmunoSpotassay 结核杆菌特异抗原早期抗原靶6 ESAT 6 earlysecretedantigenictarget6培养滤液蛋白10 CFP10 culturefiltrateprotein10 技术背景 结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞 效应T淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞因子 IFN 因此 检测效应T淋巴细胞可用于结核病或结核潜伏感染者的诊断 由于效应T细胞存活时间很短 而且具有特异性 因此可以作为机体是否正处于被感染的指标 无论是否有临床症状 基于IGRA原理的检测项目目前已被美国 加拿大 英国 德国 意大利 瑞士 法国 荷兰 日本等二十余个国家写入本国的结核诊疗指南中 干扰素释放实验 IGRA 酶联免疫斑点技术 ELISPOT 酶联免疫斑点技术 ELISPOT 近二十多年来 随着技术改良 ELISPOT分析技术已经是当世公认的最灵敏的抗原特定T细胞的体外检测技术结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术 即ELISA技术 能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况 灵敏度高 其技术原理 用抗体捕获培养中细胞所分泌的细胞
