第十八章 氨基酸1已

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1、 1 第十八章氨基酸 概述第一节氨基酸的生产第二节赖氨酸发酵第三节苏氨酸发酵第四节异亮氨酸 亮氨酸发酵 2 概述 氨基酸是构成蛋白成分 第一个用发酵法生产的氨基酸是谷氨酸 目前世界上可用发酵法生产的氨基酸有20多种 3 氨基酸的用途1 食品工业 强化食品 赖氨酸 苏氨酸 色氨酸于小麦中 增鲜剂 谷氨酸单钠和天冬氨酸苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜味剂 天冬酰苯丙氨酸甲酯 此产品1981年获FDA批准 现在每年产量已达数万吨 2 饲料工业 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 4 必需氨基酸的木桶模式图 5 6 3 医药工业 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调 苯丙氨酸与氮

2、芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气对骨髓肿瘤治疗有效 且副作用低 4 化学工业 谷氨基钠作洗涤剂 丙氨酸制造丙氨酸纤维 7 生产氨基酸的大国为日本和德国 日本的味之素 协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头 它们能生产高品质的氨基酸 可直接用于输液制剂的生产 日本在美国 法国等建立了合资的氨基酸生产厂家 生产氨基酸和天冬甜精等衍生物 8 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司 湖北八峰氨基酸公司 但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡 在80年代中后期 我国从日本的味之素 协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品 1991年销售量为二千万瓶 1996年达六千万瓶 主要

3、厂家有无锡华瑞 北京费森尤斯 昆明康普莱特 但生产原料都依赖进口 据专家估计 到2010年 世界氨基酸产值可达50亿美元 占生物技术市场的8 国内的氨基酸产值可达40亿元 占全国发酵产业总产值的12 9 第一节氨基酸的生产 一 氨基酸的生产方法 一 提取法 生产氨基酸最早采用的生产方法 将蛋白质原料酸水解 然后从水解液中抽提出氨基酸 二 直接发酵法 利用微生物的作用直接将粮食原料经过发酵生产氨基酸 野生菌株发酵 营养缺陷型突变发酵 抗氨基酸结构类似物突变株发酵 抗氨基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵 10 三 添加前体法 利用微生物转化相应的氨基酸的前体 成为相

4、应的氨基酸 如 利用嗜甘油棒杆菌将甘氨酸转化为丝氨酸 四 酶法 利用微生物产生的酶来制造氨基酸 如赖氨酸 色氨酸等可用此法 五 合成法 用化学合成的方法制造氨基酸 DL 蛋氨酸 丙氨酸 甘氨酸 苯丙氨酸 11 氨基酸生产方法的比较 12 13 二 氨基酸产生菌的选育氨基酸是细胞组分 受到严格的代谢调节控制 想让菌种积累大量的某一个氨基酸 必须打破微生物对该氨基酸的代谢调控 如选育营养缺陷型或氨基酸类似物抗性突变 可以减弱或消除氨基酸终产物阻遏 第一节氨基酸的生产 14 一 氨基酸产生菌的分离氨基酸生产菌的要求 代谢途径比较清楚 代谢途径比较简单1 产生菌的来源 采样分离 一般为细菌 棒杆菌属

5、短杆菌属 节杆菌属或小杆菌属的棒型细菌 分离时要抑制真菌 50 g mL匹马菌素 2 分离方法 平板分离 二 氨基酸产生菌的选育 15 3 筛选方法关键 设计一种适合氨基酸产生的生产培养基根据其生物合成知识设计 如谷氨酸的生产需生物素 蛋氨酸的前体为 甲基硫基 羟基丁酸等 确定一种大规模筛选的氨基酸检测方法 二 氨基酸产生菌的选育 16 氨基酸检测方法 A 平板培养 覆盖培养基 含氨基酸鉴定菌 17 B 可逆抑制测定法例 L 苯丙氨酸产生菌的筛选 2噻吩丙氨酸是枯草杆菌的抑制剂 而L 苯丙氨酸专一解除此抑制 18 C 液体培养基中氨基酸产生菌的检测a 过滤除菌发酵液 含该菌产生的AA 氨基酸测

6、定培养基 含氨基酸鉴定菌 该AA缺陷 37 16 23h 测定细胞密度或浊度 b 发酵培养基 不接种产生菌 已知浓度的特定氨基酸样品 鉴定菌 37 16 23h 测定细胞密度或浊度 19 二 氨基酸营养缺陷型突变株的选育方案1 配制以下培养基2 诱变与营养缺陷型突变株的分离3 营养要求的测定 二 氨基酸产生菌的选育 20 1 配制以下培养基 基本培养基 MM 能满足野生型菌株正常生长的培养基 完全培养基 CM 能满足各种营养缺陷型生长的培养基 如牛肉膏蛋白胨培养基 麦芽汁培养基等 补充培养基 SM 在基本培养基中加入相应的营养成分 以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基 21 2 诱变与营养

7、缺陷型突变株的分离诱变 物理诱变 化学诱变 淘汰野生型 抗生素 青霉素 法 检出缺陷型 影印法 点种法 夹层法等检出原理 利用固体培养基 缺陷型在CM上生长良好 在MM上则不生长 而野生型都能生长 22 3 营养要求的测定利用补充培养基 SM 在基本培养基中加入相应的氨基酸成分 23 三 氨基酸结构类似物抗性突变株的选育1 目的 解除氨基酸的反馈抑制和阻遏2 突变株形成原因 参看课本P3563 氨基酸结构类似物 二 氨基酸产生菌的选育 24 25 四 细胞透性改变突变株的选育1 目的 使胞内的代谢产物迅速渗漏出去 解除末端产物的反馈抑制 2 方法 透性酶 诱发突变 生理学手段 直接抑制膜的合成

8、或使膜受缺损 生物素缺陷型 膜缺损突变株 油酸缺陷型 甘油缺陷型 添加适量的青霉素 二 氨基酸产生菌的选育 26 三 氨基酸发酵的代谢控制 一 发酵条件控制 二 生产菌株的稳定 27 一 发酵条件控制 表谷氨酸产生菌因培养条件的代谢变化 33 35 34 37 28 谷氨酸发酵罐的培养基装量比为0 7 接种量为0 5 1 前期温度为33 35 后期为36 38 通气1 0 11 0 13 V V 发酵12h后开始流加尿素 维持发酵液pH在7 0以上 pH下降后再次流加尿素 需要流加3 5次 提取 发酵液用盐酸调到pH4 0 4 5 初结晶 2h后调pH3 0 3 2 降温结晶 虹吸去上层 下层

9、经离心处理的粗谷氨酸 收率可达到80 精制 粗谷氨酸溶于适量水 用活性炭脱色 加入碳酸钠 中和成盐 再进一步精制得到谷氨酸成品 29 谷氨酸的生物合成途径大致是 葡萄糖经糖酵解 EMP途径 和己糖磷酸支路 HMP途径 生成丙酮酸 再氧化成乙酰辅酶A 乙酰COA 然后进入三羧酸循环 生成 酮戊二酸 酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4 存在的条件下 生成谷氨酸 当生物素缺乏时 菌种生长十分缓慢 当生物素过量时 则转为乳酸发酵 因此 一般将生物素控制在亚适量条件下 才能得到高产量的谷氨酸 30 二 生产菌株的稳定防止回复突变 以赖氨酸发酵为例 1 增加遗传标记 如双缺陷型 hom met 2 除

10、定期纯化外 尽可能用遗传标记明显 回复率低的菌株3 营养充分 AA 防止回复突变株占优势4 添加药剂 防止回复突变株生长 如赖氨酸产生菌比回复突变株对红霉素的敏感性低 31 优先合成 反馈抑制 阻遏 32 一 赖氨酸的生物合成途径微生物的赖氨酸生物合成存在两条不同的途径 即二氨基庚二酸途径与 氨基已二酸途径 前者存在于细菌 绿藻和高等植物之中 后者存在于酵母霉菌之中 生产上用谷氨酸棒杆菌 北京棒杆菌 黄色短杆菌等细菌 理想的产生菌应为hom AECr AHVr高丝氨酸脱氢酶 hom S 2 氨基乙基 L 半胱氨酸 AEC 赖氨酸结构类似物 氨基 羟基戊酸 AHV 苏氨酸结构类似物 第二节赖氨酸

11、发酵 33 34 二 赖氨酸发酵的研究1 防止回复突变 第一节已述及 2 发酵控制 菌种 工艺不同而异 碳源 糖蜜 葡萄糖 蔗糖等 氮源 硫酸铵 尿素 氨水 玉米浆 麸皮水解液 豆饼水解液等 发酵前期 菌体生长期 很少产酸 0 20h 产酸期 至放罐工艺控制 温度32 补氨控制pH6 5 7 5 种龄和种量 供氧 维生素B1 生物素 营养盐等 35 控制氧的重要性 供氧不足 将导致乳酸积累 并可能导致赖氨酸生产受到不可逆抑制 与细胞膜透性有关 pH控制 补氨添加某些物质 培养基 菌种生长代谢状态优 可以提高赖氨酸合成量 第三节苏氨酸发酵 自学 第四节异亮氨酸 亮氨酸发酵 自学 36 思考题 1

12、 氨基酸的生产方法2 氨基酸产生菌的选育筛选的关键 3 筛选氨基酸产生菌的检测方法 请详细叙述 4 工业生产中某氨基酸高产菌株的筛选 经常选育其它代谢相关氨基酸营养缺陷型突变株 其选育原理是什么 高产原因 请详细叙述筛选方案 5 细胞透性改变突变株的选育的目的是什么 如何使产生菌的细胞透性增加 6 在氨基酸发酵生产中 一般情况下均使用营养缺陷型的生产菌株 为了菌株在发酵过程中的稳定性 如何防止产生菌发生回复突变 37 谷氨酸棒状杆菌合成谷氨酸的途径 减少 原因 生物素是脂肪酸生物合成中酶的辅基 此酶可催化物质反应 最终与合成细胞膜磷脂的主要成分 脂肪酸有关 把生物素的浓度控制在亚适量的情况下

13、才能分泌大量的谷氨酸 改变细胞膜的透性 38 黄色短杆菌合成赖氨酸的途径 高丝氨酸脱氢酶 天冬氨酸激酶 改变微生物的遗传特性 应用营养缺陷型菌株解除反馈调节 高丝氨酸缺陷型菌株不能合成高丝氨酸酶 故不能合成高丝氨酸 也不能合成苏氨酸和甲硫氨酸 在补给适量的高丝氨酸的条件下 就可产生大量的赖氨酸 39 影印法 40 菌丝过滤法筛选营养突变株 41 限量补充培养法 微量蛋白质的完全培养基上小菌落是营养缺陷型突变株 42 夹层培养法及结果 43 逐个检出法 44 三 基因突变自发性和不对应性的证明 变量试验 涂布试验 影印培养试验 45 在同一个大管中作整体培养 3714435 抗噬菌体菌落数抗噬菌体菌落数 变量试验 甲管 乙管 噬菌体起淘汰原始未突变株和鉴别抗噬菌体突变株的作用 10mL 10mL 46 涂布试验 噬菌体的加入只起鉴别抗噬菌体的自发突变是否发生 E coli 47 影印培养试验 证明微生物的抗药性突变是在接触药物前自发产生的 且这一突变与相应的药物毫不相干 E coli 48