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1、书山有路AAV病毒包装摘要 一 AAV 293细胞的冻存 二 AAV 293细胞的传代 三 AAV 293细胞的复苏 四 AAV包装和浓缩 一 AAV 293细胞的冻存随着传代的次数增加 AAV 293细胞会出现生长状态下降 突变等 为了防止此类现象的出现 我们需要在开始就对细胞进行大量冻存 以保证实验的稳定性和持续性 在细胞对数生长期进行冻存 增加细胞复苏成活率 1 去掉细胞培养上清液 加入PBS洗去残留的培养基 2 加入0 25 的胰酶 消化1 2min后 镜下观察细胞变圆 细胞间间隙加大时 去除胰酶 加入新鲜培养基吹打混匀 移入离心管中 3 细胞计数 将细胞全部晃下 加入3mL37 预热
2、的10 DMEM 用10mL移液管进行吹打 较大力吹打6 8次即可 不留死角 之后 将所有细胞吸出 置于15mL离心管中 取50ul混匀后的细胞于1 5mLeppendorf管中 加入450ul10 DMEM 即为10倍稀释 混匀 取10ul细胞于计数板中计数 计数板上共4大格 每大格16小格 计数时 4大格均计数 总数除以4 得每大格细胞数 再乘以10 10倍稀释 即为实际n万 mL细胞浓度 4 细胞离心 1000rpm min 5min 去掉上清 5 根据细胞计数 结果加入细胞冻存液 70 完全培养基 20 FBS 10 DMSO 重悬细胞 密度为3x106个 ml 6 分装进细胞冻存管
3、放入冻存盒中 放入 80 超低温冰箱 7 第二天将细胞放于液氮罐中长久保存 并作记录 保存过程中 要不时复苏细胞检测细胞存活率 观察细胞状态等 二 AAV 293细胞的传代当细胞生长到汇合率达到80 90 时需要对细胞进行传代操作 以扩大细胞数量 维持细胞良好的生长状态 1 消化细胞 方法同细胞冻存 2 细胞离心结束后 加入完全培养基重悬 3 根据具体情况 将细胞分到10cm培养皿中 每个培养皿补足到10ml培养基 三 AAV 293细胞的复苏当细胞传代次数过多 细胞状态变差时 或者细胞出现污染事故时 需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏 1 设置温度为37 42 的水浴 2 查看细胞库记录 根
4、据记录从液氮罐中取出冻存的细胞 需戴上棉手套 防止被冻伤 迅速丢入水浴锅中并快速晃动 尽量在1 2min内使细胞溶液完全溶解 3 将细胞溶液转移到15ml离心管中 并在其中加上1ml新鲜的完全培养基 混匀后离心 1000rpm min 5min 4 去掉上清 加入5ml新鲜的完全培养基 混匀沉淀后 转入6cm培养皿 5 将培养皿平稳放入37 5 CO2和95 相对湿度的培养箱中培养 6 第二天观察细胞存活率 给细胞换一下培养基 以后每天观察细胞生长情况 四 AAV包装和浓缩1 质粒扩增构建好的AAV载体 包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提 浓度大于1ug ul A260 280在 1 书山有路1
5、 7 1 8间方可用以包毒 推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提 传AAV 293细胞将培养AAV 293细胞T75瓶中的培养基吸净 加入2mL4度冰箱取出的0 25 胰酶 使其均匀覆盖瓶底 置于37度培养箱中3 5min 取出 摇晃可发现细胞于底部脱离 将其全部晃下 加入3mL37度水浴中预热的10 DMEM 移液枪用10mL移液管进行吹打 较大力吹打6 8次即可 不留死角 瓶口处较难吹打可将移液管对准培口 小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞 之后 将所有细胞吸出 置于15mL离心管中 取50ul混匀后的细胞于1 5mLeppendorf管中 加入450ul10 D
6、MEM 即为10倍稀释 混匀 取10ul细胞于计数板中计数 计数板上共4大格 每大格16小格 计数时 4大格均计数 总数除以4 得每大格细胞数 再乘以10 10倍稀释 即为实际n万 mL细胞浓度 传代当天记为第一天 若第二天进行转染 铺900 1000万 T75 若第三天转染 铺350 400万 T75 每瓶T75加10mL10 DMEM培养基 转染当天观察细胞密度 80 90 满即可进行转染 转染前无需换培养基 做脂转complex 2 试剂名称载体质粒包装质粒辅助质粒 试剂数量5ul 1 0ug ul 5ul 1 0ug ul 5ul 1 0ug ul 注 LipofiterTM转染试剂为
7、汉恒生物产品 使用说明参考LipofiterTM说明书 4 AAV病毒收毒 病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中 可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率 准备一个干冰乙醇浴 将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可 也可用液氮替代干冰乙醇浴 和37 C水浴 将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中 收集细胞时 将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中 1000rpm min 离心3分钟 分离细胞和上清 将上清另外存放 细胞用1mlPBS重悬 将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37 C水浴中反复转移 冻融四次 每次融解后稍加震荡 注意 每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间 5 AAV病毒浓缩
8、10 000g离心去除细胞碎片 将离心上清转移到一个新离心管中 将两次收集的上清混合在一起 用0 45um滤器过滤除杂质加入1 2体积的1MNaCl 10 PEG8000溶液 混合均匀 4度过夜12 000rpm离心2h 弃上清 病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解 待完全溶解后用0 22um滤器过滤除菌 加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA 终浓度为50U ml 合上管盖 颠倒几次以充分混合 在37 C孵育30分钟 用0 45 m过滤头过滤 取滤出液 即为浓缩的AAV病毒 6 AAV的纯化向病毒浓缩液中添加固体CsCl直到密度为1 41g ml 折射率为1 372 将样品加入到超速
9、离心管中 用预先配好的1 41g mlCsCl溶液将离心管剩余空间填满 在175 000g下离心24小时 以形成密度梯度 按顺序分步收集不同密度的样品 取样进行滴度测定 收集富集有AAV颗粒的组分 重复上述过程一次 书山有路5 将病毒装入100kDa的透析袋 4度透析脱盐过夜 此即为纯化的AAV病毒AAV病毒包装滴度测定 采用Q PCR法 1 取20ul浓缩病毒液 加入1ulRNAse freeDNAse 混匀 37 水浴反应30min 2 4 12000rpm min 离心10min 取10ul上清到另一个无菌的1 5mlEP管中 加入90ulDilutionBuffer 1mMTris H
10、Cl pH8 0 0 1mMEDTA 150mMNaCl 混匀 37 金属浴反应30min 自然冷却至室温 加入1ul蛋白酶K 65 水浴反应1h 100 金属浴反应10min 自然冷却至室温 进行Q PCR检测滴度 AAV病毒的储存 稀释1 病毒的储存 收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验 可以将病毒暂时放置于4 保存 如需长期保存请放置于 80 病毒置于冻存管 并使用封口膜封口 病毒可以存放于 80 6个月以上 但如果病毒储存时间超过6个月 建议在使用前需要重新测定病毒滴度 反复冻融会降低病毒滴度 每次冻融会降低病毒滴度10 因此在病毒使用过程中应尽量避免反复冻融 为避免反复冻
11、融 建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装 2 病毒的稀释 如果需要稀释病毒 请将病毒取出置于冰浴融解后 使用PBS缓冲液或培养目的细胞无血清培养基 含血清或含双抗不影响病毒感染 混匀分装后4 保存 请尽量在三天内用完 分装后使用 AAV使用安全注意事项病毒操作时最好使用生物安全柜 如果使用普通超净工作台操作病毒 请不要打开排风机 病毒操作时请穿实验服 带口罩和手套 操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅 如果操作时超净工作台有病毒污染 请立即用70 乙醇加1 SDS溶液擦拭干净 接触过病毒的枪头 离心管 培养板 培养液等请用84消毒液或1 SDS中浸泡过夜后弃去 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤 拧紧培养瓶或盖紧培养板 用70 乙醇清理培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照 离开显微镜实验台之前 用70 乙醇清理显微镜实验台 如需要离心 应使用密封性好的离心管 或者用封口膜封口后离心 而且尽量使用组织培养室内的离心机 脱掉手套后 用肥皂和水清洗双手 3
