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1、双向电泳操作经验及解析蛋白质组研究概述1双向电泳样品制备2双向电泳操作解析3荧光差异双向电泳4目录染色及差异分析5蛋白质组研究概述1双向电泳样品制备2双向电泳操作解析3荧光差异双向电泳4目录染色及差异分析5蛋白质组学研究必要性生物调控机制的复杂性： 涉及多个基因的多个层次的系统调节蛋白质： 基因功能的执行者，调控更为直接蛋白质组学： 从全局和整体的角度发现去解决问题，分析更为全面蛋白质组学与代谢组学等其它策略相结合： 发展的新趋势From DNA to Protein From Protein to Metabolite数据库： NCBI-PUBMED 时间： 2011年 9月 5日条件：标题
2、检索 词汇：物种名 +proteome蛋白质组学研究现状表达蛋白质组学：9人类肝脏蛋白质组计划9人类血浆蛋白质组计划比较蛋白质组学：9动物疾病的发病机制9植物抗逆的分子机理9生物标志物发掘蛋白质互作组学蛋白质翻译后修饰蛋白质组学主要研究方向凝胶非凝胶双向凝胶电泳 (2-DE)荧光差异双向电泳 (DIGE)二维色谱 (2D-HPLC)毛细管电泳 (HPCE)分离一级质谱 (MS-PMF)串联质谱 (MS/MS)部分序列比对 (Sequence Query)鉴定计算机辅助（ PDquest、 Mascot）蛋白质组学研究常用技术 优点： 蛋白质组研究的经典技术、分辨率高、可视性好 缺点： 重复性不
3、高、对于极端等电点和极端分子量蛋白分离效果不好蛋白质双向凝胶电泳部分仪器设备等电聚焦仪 SDS-PAGE电泳仪 凝胶扫描仪蛋白质双向凝胶电泳CBB StainpH4 712% SDS-PAGE蛋白质双向凝胶电泳Silver Stain常规双向电泳荧光差异双向电泳蛋白质双向凝胶电泳蛋白质组研究概述1双向电泳样品制备2双向电泳操作解析3荧光差异双向电泳4目录染色及差异分析5生物样品分类真菌细菌植物动物其它生物分类体液亚细胞细胞组织其它形态分类高低次生代谢物低高蛋白含量有无液泡有无细胞壁植物组织动物组织特性 细胞壁： 增强细胞坚韧程度，同时也增加细胞破碎难度 液泡： 含有多糖多酚类物质，干扰蛋白提取
4、 蛋白含量： 需要的样本量与样本蛋白含量高低密切相关，同时蛋白含量较低的植物样品往往需要通过一些方法进行蛋白富集 次生代谢物： 植物组织次生代谢物质含量高，一方面降低蛋白含量、另外也可能干扰蛋白提取以动植物组织为例：生物样品分类高溶解能力： 尽可能提取出最大量的蛋白，减少蛋白损失去杂： 多糖、 DNA、蜡质、多酚、油脂高浓度： 蛋白沉淀、冻干、超滤进行浓缩去高丰度蛋白： 白蛋白、 IgG、 Rubisco避免蛋白损失和人为修饰： 减少操作步骤、含尿素溶液温度不要超过 37度避免降解： 减少操作步骤、低温操作、添加蛋白酶抑制剂样品制备要求 机械方法：9 液氮研磨： 细菌、动植物组织9 高速匀浆：
5、 细菌、动植物组织 物理方法：9 超声处理： 细菌、脑组织匀浆、培养的动物细胞9 反复冻融： 培养的动物细胞9 冷热交替： 培养的动物细胞 化学方法：9 裂解液裂解： 培养的动物细胞9 酶溶解： 细菌、酵母样品破碎方法常用制备方法直接裂解法：9优点： 操作简单，速度快、蛋白得率高9缺点： 杂质多9适用样品： 动物组织或细胞TCA/丙酮沉淀法：9优点： 蛋白纯度高9缺点： 操作繁琐、速度慢，蛋白损失多9适用样品： 植物组织、体液、胞外分泌蛋白常用制备方法超滤法：9优点： 操作简单，速度快9缺点： 费用贵9适用样品： 胞外分泌蛋白、体液、尿液其它方法：9硫酸铵沉淀法9酚抽提法9酒精提取法9 蛋白裂
6、解液配置蛋白裂解液成分：变性剂： 尿素、硫脲去污剂： 两性去污剂 (CHAPS)、非离子去污剂 (NP-40、 Triton-100)、阴离子去污剂 (SDS)还原剂： DTT、 DTE、 TBP、 2-巯基乙醇增溶剂： 两性电解质、 Tris碱常用裂解液： Tris裂解液： 40mM Tris (pH=9.5)尿素裂解液： 9M 尿素、 4%CHAPS、 1%DTT、 1% CA尿素硫脲裂解液： 7M 尿素、 2M硫脲、 4%CHAPS、 1%DTT、 1% CA常用样品保存方法及保存时间一次一次多次反复使用次数数年数年1个月保存时间冻干成蛋白干粉后冷冻保存冷冻保存于 -20度、 -80度或
7、液氮条件4度保存于蛋白溶液特性蛋白提取常见问题实例Buffer： 7M尿素、 2M硫脲、4%CHAPS、 1%DTT、 1%IPG buffer症状： 靠近酸性端形成纵向分割，形成 “半面妆 ”可能原因： 硫脲使烷基化不完全改进： 裂解液中不添加硫脲Buffer： 9M尿素、 4%CHAPS、1%DTT、 1%IPG buffer蛋白提取常见问题实例症状： 蛋白点数目差异较大可能原因： 不同裂解液蛋白裂解能力不同改进： 选用裂解能力强的裂解液 Lysis A (1826 spots)： 8M尿素、2%CHAPS、 20mMDTT、 0.5% CA (pH=4-6.5) Lysis B (133
8、7 spots)： 7M尿素、 2M硫脲、 4%CHAPS、 25mMDTT、 1% CA (pH=4-6.5)Lysis C (1033 spots)： 8M尿素、4%CHAPS、 25mMDTT、 0.5% CA (pH=4-6.5) Lysis D (2226 spots)： 5M尿素、 2M硫脲、 2%CHAPS、 2%SB3-10、 20mMDTT、5mM TCEP、 0.5% CA (pH=4-6.5)、 0.5% CA (pH=3-10)Drystrip: pH=4-7症状： 出现拖尾、蛋白点少、蛋白点分布不均匀可能原因： 蛋白样品杂质去除不干净改进： 选用 TCA/丙酮沉淀法或
9、其它方法去除干扰物质TCA/丙酮沉淀法提取蛋白直接裂解法提取蛋白蛋白提取常见问题实例症状： 产生分段横条纹可能原因： 盐离子的干扰改进： 可以采用丙酮沉淀、超滤以及 clean up试剂盒处理的方法进行上样前的盐离子去除，也可以采用杯上样、搭盐桥或者缓慢升压等方法在电泳时进行盐离子去除蛋白提取常见问题实例Add 30mM NaClNo Salt症状： 部分区段产生严重背景可能原因： 样品多糖、多酚等成分的干扰改进： 可以采用丙酮沉淀、 TCA沉淀或添加 PVPP等方式去除杂质蛋白提取常见问题实例症状： 蛋白丢失比较严重且堆积在一个小区域范围内可能原因： 蛋白溶液中有 TCA等酸性物质残留改进：
10、 采用丙酮沉淀等方法充分去除酸性物质蛋白提取常见问题实例症状： 出现连续横向拖尾可能原因： 蛋白溶解不充分改进： 选用蛋白溶解性强的裂解液，上样前充分离心蛋白提取常见问题实例症状： 蛋白出现在低分子量区域可能原因： 蛋白提取过程中的蛋白降解改进： 注意获取样品后及时冷冻保存，样品提取过程中注意低温，裂解液中添加蛋白酶抑制剂蛋白提取常见问题实例蛋白质组研究概述1双向电泳样品制备2双向电泳操作解析3荧光差异双向电泳4目录染色及差异分析5蛋白定量 Bradford法： 染料与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸 )和芳香族氨基酸残基结合显色9优点： 灵敏度 1-5ug、速度快、操作简单、显色稳定9缺
11、点： 不同蛋白检测浓度有偏差， SDS、去污剂、 Tritonx-100等对检测有干扰，标准曲线有轻微的非线性 Lowary法： 碱性条件蛋白质与铜作用生成蛋白质铜复合物，该复合物将磷钼酸 -磷钨酸还原后显色9优点： 灵敏度 20-250ug9缺点： 费时、干扰物质多 (Tris缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化物、酚类、柠檬酸等 )，标准曲线的直线关系不严格蛋白上样量胶条 pH范围： 范围越窄，上样量越大胶条长度： 胶条越长，上样量越大染色方法： 灵敏度越低，上样量越大有效蛋白比： 比例越低，上样量越大1000-1500考染200-400银染4-7500-1000考染150-300银染3-10上样
12、量(ug)染色方法pH范围表：参考上样量(材料为无明显高丰度蛋白的样品、胶条长度24cm)胶条与两性电解质的对应关系常用非线性胶条的 pH分布规律等电聚焦操作细节胶条从冰箱中取出后需在室温平衡 10分钟才可使用蛋白溶液在上样前需充分离心以去除不溶性杂质加入蛋白溶液时，尽量使溶液保持连贯，并避免气泡产生蛋白溶液体积要足量以免水化不充分放入胶条时需从一端开始缓慢连续放入，避免气泡产生，如有气泡可通过缓慢来回拖动胶条将气泡赶走设置缓慢升压步骤有利于除盐和除杂夏天空气湿度过大时注意及时除湿等电聚焦电压设置 低压水化： 50V-12h 缓慢升压除盐： 100V-1h，200V-1h， 500V-1h，
13、1000V-1h， 1000-10000V-1h 高压聚焦： 10000V-10h 低压维持： 500V-nhpH4 712% SDS-PAGE24cm Drystrip, CBB stain-1000ug蛋白平衡操作细节等电聚焦完成后的胶条可以马上进行平衡，也可以用保鲜膜包裹后放在 -80度条件下长期保存胶条平衡前用半干滤纸吸取胶面上的覆盖油和多余样品，可以有效减少纵条纹的产生平衡两次，每次 15分钟，时间太短会导致平衡不充分，影响蛋白分离效果，太长则会引起蛋白丢失可以采用丙烯酰胺替代 IAA进行第二步平衡操作，效果也不错平衡缓冲液体积需足量且淹没整根胶条平衡后将胶条在电泳缓冲液中浸泡一下有
14、助于蛋白更好地向第二向胶转移胶条转移及 SDS-PAGE电泳操作细节采用琼脂糖封胶时注意防止胶条和第二向凝胶表面产生气泡（建议夏天采用普通琼脂糖、冬天采用低熔点琼脂糖进行封胶）灌制 SDS-PAGE凝胶时注意胶溶液、灌胶槽以及室温保持一致，可以使灌制的凝胶更均匀灌制凝胶时先缓慢加入胶液，待底部气体去除后再稍快加入剩下的胶液，可以有效防止底部气泡的产生 控制凝胶在2小时内凝固完全 加胶条前，采用电泳缓冲液冲洗SDS-PAGE凝胶上表明，有利于蛋白从胶条向第二向凝胶的转移 分两步进行SDS-PAGE电泳，有效防止纵条纹的产生pH=4-7症状： 碱性端出现大量蛋白未能得到很好的分离可能原因： 胶条
15、pH范围选择不正确改进： 根据样品情况选择合适 pH范围的胶条双向电泳操作常见问题实例750ug1500ug症状： 蛋白点较少可能原因： 蛋白上样量过低改进： 加大蛋白上样量双向电泳操作常见问题实例症状： 高丰度蛋白点中间颜色比周边浅可能原因： 银染蛋白过饱和改进： 选择合适的蛋白上样量双向电泳操作常见问题实例症状： 高丰度蛋白出现横纹可能原因： 蛋白上样量过高改进： 适当降低蛋白上样量，如有过可能，尽量去除高丰度蛋白双向电泳操作常见问题实例症状： 纵向区域出现严重波浪纹可能原因： 聚焦槽中有水分未去除改进： 准备等电聚焦前先把聚焦槽自然风干或者烘干双向电泳操作常见问题实例症状： 部分区域垂直方向出现连续横条纹可能原因： 蛋白水化不充分改进： 水化液体积需足量、水化时间足够长双向电泳操作常见问题实例症状： 碱性端蛋白纵向拖尾可能原因： 等电聚焦过程中的 DTT丢失改进： 加入足量并且有效的 DTT，胶条水化后采用杯上样，采用 TBP代替
