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1、DB21辽宁省地方标准 （ 辽宁省质量技术监督局发布） DB21/T17302009北虫草菌种生产技术规程1 范围本标准规定了北虫草菌种定义，制作要求，质量要求，标志及储存要求。本标准适用于北虫草菌种生产。2 规范性引用文件GB/T191-2008 外包装储运图示标志GB/T6388-1986 运输包装收发货标志NY/T528-2002 食用菌菌种生产技术规程食用菌菌种管理办法 （中华人民共和国农业部第 62 号令发布）3 定义本标准采用下列术语和定义3.1 北虫草菌种北虫草生物学分类地位属于子囊菌纲，肉座菌目，麦角菌科，虫草属，蛹虫草。它是以中国北方野生蛹虫草为样本，采用组织或孢子分离法，经
2、分离、纯化、驯化，选育获得的具有一致性、稳定性、结实性的真菌菌种，经人工培养进一步扩大繁殖以及用于栽培生产的纯菌丝培养物，包括固体母种和液体生产种。3.2 固体母种北虫草菌种的纯菌丝固体培养物及其继代固体培养物，以玻璃试管为培养容器和使用单位，又称一级菌种、试管菌种。3.3 液体生产种由固体母种接种于液体培养基扩繁而来的纯菌丝液体培养物，培养容器为玻璃瓶或发酵罐，只用于生产不能用于菌种扩繁。4 制作要求4.1 技术人员具有生产北虫草菌种的专业技术人员。4.2 环境要求4.2.1 环境卫生场地要求远离禽畜设施，垃圾场，无污水和其他污染源，通风，透光，地面及四周无灰尘，无虫害等。4.2.2 设置和
3、布局 按 NY/T528 中的 4.3 规定执行（截选）应按菌种生产工艺合理安排布局。4.2.2.1 灭菌室要求水电安装方便，通风良好，空间充足，散热畅通。4.2.2.2 冷却室洁净，防尘，易散热。4.2.2.3 接种室要设缓冲间，防尘换气性能好，内壁和屋顶光滑，便于清洗和消毒，做到空气清新。4.2.2.4 培养室和储存室内壁和屋顶光滑，便于清洗和消毒。培养室和储存室墙壁要加厚，利于控温。4.2.2.5 菌种实验室水电方便，利于装备相应的检验设备和仪器。4.2.3 设备设施 按 NY/T528 中的 4.4 规定执行（截选）4.2.3.1 基本设备磅称、天平、高压灭菌锅或常压灭菌锅、净化工作台
4、、接种箱、调温设备、除湿机、培养架、恒温箱、冰箱、显微镜等常规用具，产量大的菌种厂还应配备搅拌机、装瓶装袋机。高压灭菌锅应使用经有关部门检验的安全产品。4.2.3.2 基本设施配料、分装、灭菌、冷却、接种、培养等各环节的设施规模要配套。冷却室、接种室、培养室和储存室都要有调温设施。4.3 菌种生产工艺流程4.3.1 流程顺序培养基配制 分装 灭菌 冷却 接种 培养 检查 成品4.3.2 培养原料用马铃薯、玉米粉、蚕蛹粉、大豆粉、豆粕粉、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏（粉） 、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、维生素 B1 等为原料，经配制后作为北虫草的营养基质。其中，玉米粉、蚕蛹粉、大豆粉、豆粕粉为市售产品，
5、要求无结块无变质；马铃薯出芽变绿的不能使用；蛋白胨、酵母膏（粉）为生化试剂；葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、为化学纯以上级试剂；琼脂、维生素 B1为食品级以上产品；水为自来水等可饮用水。4.3.3 培养容器4.3.3.1 固体母种生产容器使用玻璃试管和胶塞，试管规格为 18180mm 或 20200mm，试管塞一般采用胶塞，保存时间短直接用于液体生产种的可以使用棉塞，不能使用脱脂棉做试管塞。4.3.3.2 液体母种生产容器使用 250ml、500ml 玻璃输液瓶，用聚丙烯薄膜和乳胶圈封口。4.3.4 培养基配制与分装4.3.4.1 固体母种培养基配制与分装4.3.4.1.1 固体母种培养基配方a)
6、 马铃薯 200g，葡萄糖 20 g，磷酸二氢钾 3 g，硫酸镁 1.5 g，维生素 B1 10 mg，琼脂20 g，水 1000ml，PH6.0-7.0。b) 葡萄糖 100 g，蛋白胨 10g，酵母膏 1g，磷酸二氢钾 3 g，硫酸镁 1.5 g，琼脂 20 g，水 1000ml，PH6.0-7.0。4.3.4.1.2 固体母种培养基配制与分装按配方称好各种原料，将马铃薯洗净去皮去芽眼，切成 3-5mm 薄片，加水 1000ml，文火煮沸 20-30 分钟，搅拌溶解后，加开水补足至 1000ml，趁热分装试管，装量为试管的1/4-1/5，塞入胶塞。4.3.4.2 液体生产种培养基配制与分装
7、4.3.4.2.1 液体生产种培养基配方a) 马铃薯 200g，蚕蛹粉 10g，葡萄糖 20 g，磷酸二氢钾 3 g，硫酸镁 1.5 g，维生素 B1 50 mg，水 1000ml，PH6.0-7.0 。b) 葡萄糖 100 g，蛋白胨 10g，酵母膏 1g，磷酸二氢钾 3 g，硫酸镁 1.5 g，琼脂 20 g，水 1000ml，PH6.0-7.0。4.3.4.2.2 液体生产种培养基配制与分装按配方称好各种原料，将马铃薯去皮去芽眼，称取 200g，切成 3-5mm 薄片，与蚕蛹粉（或其它配方中的玉米粉、大豆粉、豆粕粉等农产品原料）一起放入锅中，文火煮沸 20-30分钟，用 8 层纱布过滤，
8、滤液用开水补足至 1000ml，再依次加入其它成分，搅拌溶解，然后装入玻璃输液瓶中，液体装量不宜超过容器总容积的 2/5，瓶口用聚丙烯薄膜和乳胶圈封口。4.3.5 培养基灭菌与冷却4.3.5.1 固体母种培养基灭菌与冷却 按 NY/T528 中的 4.7.5 规定执行（截选）母种的培养基配制和分装后应立即灭菌；原种和栽培种培养基配制后应在 4h 内进锅灭菌。灭菌完毕后，应自然降压。灭菌时应防止棉塞被冷凝水打湿。4.3.5.2 液体生产种培养基灭菌与冷却采用常压灭菌或高压蒸汽灭菌，灭菌方法和规程可参照固体母种培养基灭菌，要点为：常压灭菌时 2h 内使温度达到 100保持 6-8 小时；高压蒸汽灭
9、菌 0.11Mpa 保持 30 分钟；高压蒸汽灭菌一定要等灭菌器的压力降为零时，才可开启灭菌器，取出菌种瓶；菌种瓶冷却至室温后方可接种。4.3.5.3 培养基灭菌效果的检查 按 NY/T528 中的 4.7.6 规定执行（截选）母种培养基置于 28恒温培养，原种和栽培种培养基经无菌操作接种于 GB4789.28-1994中规定的营养肉汤培养基中，于 28恒温培养，48h 后检查，无微生物长出的为灭菌合格。4.3.6 接种4.3.6.1 固体母种接种 按 NY/T528 中的 4.7.8 规定执行（截选）4.3.6.1.1 接种室（箱）的基本处理程序清洁 搬入接种物和被接种物 接种室（箱）的消毒
10、处理。4.3.6.1.2 接种室（箱）的消毒处理方法用药物消毒并用紫外线灯照射。4.3.6.1.3 净化工作台的消毒处理方法先用 75%酒精或新洁尔灭溶液进行表面擦拭消毒，然后预净 20min。4.3.6.1.4 接种操作在无菌室或净化工作台上严格按无菌操作接种。接种完成后及时贴好标签。4.3.6.1.5 接种室（箱）后处理接种室（箱）每次使用后，要及时清理清洁，排除废气，清除废物，台面要用 75%酒精或新洁尔灭溶液擦拭消毒。4.3.6.1.6 培养室处理在使用培养室的前两天，采用药物消毒。4.3.6.2 液体生产种接种在无菌操作条件下，用接种钩从母种斜面中切取 12 菌面（可稍带培养基）放入
11、液体菌种培养瓶中，迅速用聚丙烯薄膜和乳胶圈封口。每支母种可接种 10-15 瓶液体生产种。4.3.7 菌种培养4.3.7.1 培养条件4.3.7.1.1 菌种培养温度 18-23。4.3.7.1.2 菌种培养湿度 60-65%。4.3.7.1.3 菌种培养光线为黑暗条件。4.3.7.1.4 菌种培养空气为环境清新无异味。4.3.7.2 培养时间4.3.7.2.1 固体母种 7-10 天可长满试管。4.3.7.2.2 液体生产种的生产，主要采用摇床振荡培养，振荡频率依据摇床性能和菌种性质进行适当调节，要求培养的菌种菌球密度大，菌丝挂瓶壁少，培养周期短以及接种后定殖能力强，发菌快。一般往复式摇床
12、60-70 次/分钟，旋转式摇床100-120 转/分钟，振荡培养时间为 4-6 天；没有设备条件的可采用静止培养，静止培养时间为 7-10 天。4.3.8 培养期的检查4.3.8.1 检查次数培养期间定期检查，一般每天检查 2 次，及时淘汰染菌及劣质菌种。4.3.8.2 质量要求4.3.8.2.1 固体母种质量要求固体母种质量要求应符合表 1 的规定。表 1 固体母种质量要求项 目 要 求菌丝菌丝长满基质斜面，菌苔粉末状或短绒毛状，橘黄色或橘红色，厚薄均匀一致，无明显白色绒毛状气生菌丝；无杂菌；菌苔底部呈黄色。原基 母种试管在 2-4的条件下长时间保存可出现原基。转代次数 一代母种转代不超过
13、 3 次。镜检 菌丝丝状，均匀一致，无杂菌。4.3.8.2.2 液体生产种质量要求液体生产种质量要求应符合表 2 的规定。表 2 液体生产种质量要求项 目 要 求菌丝 菌丝絮状或小球状，均匀一致，挂瓶壁的菌丝短绒毛状，淡黄色。杂质 无任何杂质。培养液 菌液澄清透明，菌球在菌液中分散均匀，无上浮，无沉淀。气味 有北虫草独有的菌香味，无异味。镜检 菌丝直径与分枝均匀一致，无其它真菌和细菌。5 标志5.1 合格的菌种必须贴有标签，应符合 GB/T191 GB/T6388 的规定。5.2 标签应标明厂名、厂址、生产单位、接种日期、保质期、注意事项等。6 储存6.1 固体母种经储存一段时间后再使用，应进行转代扩繁和出草试验。6.2 液体生产种在 2-4环境中保质期 7-10 天。
