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1、2.6.12 非无菌产品微生物检测：微生物计数试验1. 简介这个实验叙述了从今以后在有氧条件下嗜温性细菌和真菌生长的定量计数要求。设计这个实验旨在确定药物或制剂是否符合已建立的微生物质量要求规范。当用作上述目的时，可参考下面的说明，包括所取样品的量及以结果的解释。该方法不适用于将微生物作为有效成分的产品。可以运用包括自动化方法在内的替代微生物方法。但要求已被证明其等价于药典方法。2. 通用方法在拟定的条件下进行试验，拟定的条件旨在避免待测产品的外在微生物污染。采取的避免污染的措施必须不影响任何测试中需要披露的微生物。如果待测产品具有抗菌活性，尽可能取消或者解除这个活性。如果是用灭活剂，则它的效
2、用和毒性情况必须说明。3. 计数方法按照规定使用膜过滤法或者平板计数法。最可能数目法（MPN）是微生物计数法中精密度最差的方法。然而，对于特定的低生物负荷的产品组，可能是最适宜的方法。方法的选择是基于如产品属性，微生物限度要求等因素进行选择的。 选择的方法必须进行大量的样品检测来判断是否符合规范。并建立其方法的适用性。4. 促生长实验，计数方法的适用性和阴性对照4-1. 总则需建立有样品进行试验的条件下微生物测试的性能状况。检验条件改变或样品改变时，因影响其测量结果，则应确定其适用性。4-2. 试验菌株制备用标准的、稳定的试验菌株悬浮液或者将它们按以下步骤制备。因使用种子批培养保留技术（种子批
3、技术），则用于接种的可用的微生物从原始的第一代开始继代培养不能超过 5 代。且按照 2.6.12.-1 表所示将每一批细菌和真菌等试验菌株进行独立培养。使用 pH7.0 的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或者 pH7.2 磷酸缓冲溶液来制备实验所用的菌悬液。对于曲霉孢子菌悬液，可以将 0.05%的聚三梨醇酯 80 加入到缓冲溶液中。且应在 2 小时或 2-8条件下 24 小时内应用。稀释曲霉或者枯草杆菌的新鲜营养细胞悬浮液得到稳定的孢子悬浮液，然后取适宜体积的孢子悬浮液用于试验接种。这个稳定的孢子悬浮液可在 2-8的条件下，验证时间内保存。4-3. 阴性对照为了验证试验条件，使用选择的稀释剂代替供试品进行
4、试验，它不能有微生物生长。第 5 部分的产品检测中也要有阴性对照。如果阴性对照失败，应进行调查。4-4. 培养基的促生长测试每一批制备好的培养基，和由脱水制备或者按成分制备每一批培养基。按表 2.6.12.-1 所示，在酪蛋白大豆肉汤培养基和酪蛋白大豆琼脂培养基中接种少量微生物菌种（不超过 100 个菌落形成单位），且每一种菌都单独使用培养基。在沙氏 -葡萄糖琼脂培养基上接种菌种少量微生物菌种（不超过 100 个菌落形成单位），每一种菌都单独使用培养基。按表2.6.12.-1 所示的条件下培养。对于固体培养基，获得的生长结果不得超过由标准接种而来的计算值的两倍范围。对新制备的菌种，微生物的生长
5、状况应与以前测试过的、经批准的培养基的微生物作比较。对于液体培养基，其与以前测试过的、经批准的培养基比较有清晰可见的微生物生长，那么液体培养基被认为是可试用的。表 2.6.12.-1试验菌的制备及应用促生长 有样品的情况下，微生物计数 方法的适用性微生物 实验菌株的制备 总需氧微生物计数总酵母菌和霉菌的计数总需氧微生物计数总酵母菌和霉菌的计数金黄色葡萄球菌ATCC6538NCIMB9518CIP4.83NBRC13276酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-3518-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基100CFU30-353天酪蛋白大豆琼脂培养基100CFU30-353
6、天 绿脓假单胞菌ATCC9027NCIMB8626CIP82.118 NBRC13275酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-3518-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基100CFU30-353天酪蛋白大豆琼脂培养基100CFU30-353天 枯草芽孢杆菌ATCC6633NCIMB8054CIP52.62NBRC3134酪蛋白大豆琼脂培养基或酪蛋白大豆肉汤培养基30-3518-24h酪蛋白大豆琼脂培养基和酪蛋白大豆肉汤培养基100CFU30-353天酪蛋白大豆琼脂培养基100CFU30-353天 白色念珠菌ATCC10231NCPF3179IP48.72NBRC1594
7、沙氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄糖琼脂培养基20-252-3 天酪蛋白大豆琼脂培养基100CFU30-355天 沙氏-葡萄糖琼脂培养基100CFU20-255天酪蛋白大豆琼脂培养基100CFU30-355天沙氏-葡萄糖琼脂培养基100CFU20-255天黑曲霉ATCC16404IMI149007IP1431.83NBRC9455 沙氏-葡萄糖琼脂培养基或马铃薯葡萄培养基糖琼脂培养基20-255-7 天，或直到获得好的芽孢酪蛋白大豆琼脂培养基100CFU30-355天沙氏-葡萄糖琼脂培养基100CFU20-255天 酪蛋白大豆琼脂培养基100CFU30-355天沙氏-葡萄糖琼脂培养基100CF
8、U20-255天4-5. 样品存在时计数方法的适用性4-5-1. 样品的制备根据被测样品的物理特征选用合适的样品制备方法。如果以下描述的方法都不行，则应开发替代方法。 水溶性产品 用 pH7.0 的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或 pH7.2 的磷酸盐缓冲溶液或酪蛋白大豆 肉汤培养基溶解、稀释测产品（通常 1：10 的稀释）。必要时，调节 pH 在 6-8.之间；用同一稀释剂稀释成更高倍数的稀释液。水不溶性非脂肪产品 用 pH7.0 的氯化钠蛋白胨缓冲溶液或 pH7.2 的磷酸盐缓冲溶液或酪蛋白大豆肉汤培养基奖产品制成悬浮液（通常 1：10）。可将表面活性剂如 1g/ml 的聚三梨醇酯 80 加入到悬浮
9、液中以增强可湿性差的的物质的悬浮。必要时，调节 pH 在 6-8.之间；用同一稀释剂稀释成更高倍数的稀释液。脂肪性产品 将其溶解于十四酸异丙酯中，无菌膜过滤或者将产品与最少需要量的无菌聚三梨醇酯 80 或者其他非抑制性无菌的表面活性剂混合。必要时，加热至不超过 40，对于特殊产品不超过 45。小心的混匀，必要的时候在水浴锅中保温。加入足量的预先温热的稀释剂制成原始产品 1：10 的稀释溶液。混匀后，应尽量缩短其保温时间以免形成乳胶。用含有合适浓度的聚三梨醇酯 80 或其他非抑制性无菌的表面活性剂得相同稀释剂稀释成更高倍数的悬浮液。液体或固体喷雾剂 无菌条件下，转移产品至薄膜过滤器中或者其它灭菌
10、容器中待进一步取样。取容器中所有的量或规定量用于检测。贴剂 撕开贴剂的保护层（露出内衬 ），胶贴面朝上放置在灭菌玻璃或者塑料托盘上。用无菌多孔材料如无菌纱布盖住胶贴面，以防止贴剂黏在一起，然后将贴剂放入含有灭活剂如聚三梨醇酯 80 或卵磷脂的稀释剂中，剧烈振荡至少 30min。4-5-2接种和稀释将一定体积的微生物悬浮液加入到按照（4-5-1）准备好的样品和对照溶液（不含检测样品）中，其结果不能超过 100 个的菌落形成单位。且其微生物悬浮液的接种体积不能超过稀释样品体积的 1%。为了测定样品中的微生物回收率，应用准备好的样品的最低稀释剂进行试验，如果其产品具有抗菌活性或溶解性差时，应找其他可
11、可用的方法替代。如果不能避免样品中微生物出现生长抑制时，则微生物的悬浮液应在中和、稀释或过滤后加入。4-5.3中和/除去抗菌活性按 4-5-2 中稀释样品和按 4-5-4 中方法培养样品得到的微生物数与对照组中的微生物数作比较。如果生长被抑制（减少超过 2 倍量），那么对计数试验进行修改并对结果进行验证。修改的步骤可能包括：例如，（1）增加稀释剂或培养基的用量，（2）在稀释剂中加入指定的或者通用中和剂，（3 ）薄膜过滤（4）将上述措施相结合。中和剂 中和剂可用于中和药物的抗菌活性（表 2.6.12.-2），它们可以在所选择的稀释剂或培养基灭菌前加入。使用时，应通过有中和剂无样品的空白对照来表明
12、其中和剂对微生物的效力和毒力。表 2.6.12.-2-常见的干扰物质的中和剂干扰物质 可用的中和方法戊二醛，有机汞制剂 亚硫酸氢钠（亚硫酸氢钠）酚醛树脂，醇，醛，山梨酸酯 稀释醛 甘氨酸季铵化合物（QACs），羟基苯甲酸， 2-双胍类 卵磷脂季铵化合物（QACs），碘，羟基苯甲酸 聚山梨酯汞制剂 巯基醋酸酯汞制剂，卤素，醛 硫代硫酸盐EDTA（乙二胺四醋酸盐） 镁离子或者钙离子如果找不到适宜的中和方法，则可将分离微生物失败的原因归因于产品的微生物活性。此信息表示产品不太可能被特定种类微生物污染。然而，产品可能只抑制某些特定的微生物，而不抑制另外的、没有包括在试验菌株内的微生物或者不具有代表性的
13、微生物。然后，用最高稀释倍数的样品做微生物的生长和具体验收标准兼容性测试。4-5-4. 有样品时微生物的回收率对于每一个列出的微生物都必须进行单独的试验。只计算试验菌的生长数量。4-5-4-1. 薄膜过滤使用有标称孔径不超过 0.45m的膜进行过滤。应选择细菌截留率不受被测样品的组分影响的过滤材料。对列出的每一种微生物都个使用一个过滤器。按照 4-5-1 至 4-5-3 所准备的样品取适量(一般为产品的 1g 量，如预期的 cfu 较大时，可以取少量) 至膜过滤器，用适宜体积的稀释液冲洗膜过滤器。对于总需氧菌数的测定(TAMC)，转移过滤后的膜至酪蛋白大豆琼脂培养基平板上。为了测定酵母菌和霉菌
14、的总数（TYMC)，转移过滤后的膜至沙氏 -葡萄糖琼脂培养基平板上。根据表2.6.12.-2.定义的接种上述培养基，进行计数。4-5-4.2. 平板计数法平板计数法要求每种培养基至少配制两个以上，结果用平均计数法计算。4-5-4-2-1. 倒板法用直径为 9 厘米的培养皿，加入 1ml 的根据 4-5-1 至 4-5-3 制备的样品和 1520ml 的酪蛋白大豆琼脂培养基或者沙氏- 葡萄糖琼脂培养基，其培养基的温度不超过 45。如果使用较大的培养皿，可以适当增加培养基的用量。对于每一个表 2.6.12.-1 中列示的微生物，至少制备两个培养皿。并按照 2.6.12.-1.定义培养。每个培养基按
15、算术平均计数，并计算最初接种的 cfu 值。4-5-4-2-2. 表面扩散法在直径为 9cm 的培养皿中，加入 15-20ml 45左右的酪蛋白大豆琼脂培养基或者沙氏- 葡萄糖琼脂培养基，固化。假如使用较大的培养皿，可以适当增加培养基的用量。在层流空气流柜或者培养箱内干燥平板，对于在表 2.6.12.-1 中所列示的每种微生物至少制 2 个平板。然后取不少于 0.1ml 按 4-5-1 至 4-5-3 描述准备的样品到培养基表面上涂布。按 4-5-4-2-1 所描述的培养和计数。4-5-4-3最可能数目法（MPN） MPN 的精密度和准确度小于膜过滤法和平板计数法。特别是模具枚举法得到的不可靠
16、的结果。由于这个原因 MPN 法是好氧微生物测定的保留方法，在没有其它方法可用的情况下可用。假如使用的方法是合理的，按照如下所述进行。准备一系列至少 3 个顺序的产品的十倍稀释液如 4-5-1 至 4-5-3 所述。从每个稀释水平，3等分 1g 或者 1ml 用于接种 3 个装有 9-10ml 大豆酪蛋白消化肉汤培养基的试管。如果有必要，表面活性剂例如吐温 80 或者抗生素抑制剂可能被加入到介质中。因此，假如 3 个水平的稀释液被制备，要接种 9 个试管。所有试管的接种在 30-35下进行不超过 3 天的时间。如果结果读取较为困难或者由于被测产品的性质而不确定 ，在同样的肉汤培养基内次培养，或者在大豆酪蛋白消化肉汤中相同温度下培养 1-2 天，使用此结果。从 2.6.12.-4.测定每 g 或者每 ml 被测产品中最有可能的微生物数量。4-6. 结果和诠释当验证膜过滤法或者平板计数
