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1、嗜血杆菌的分离和鉴定 卫生部北京医院陈东科 2019 1 概述 嗜血杆菌属 Haemophilus 属于巴斯德菌科 是专性寄生的苛养性细菌 该属细菌主要寄生在人的咽喉及口腔粘膜 少见于消化道和生殖道 其中流感嗜血杆菌主要引起人类急性化脓感染 急性咽炎 喉炎 气管炎 肺炎 中耳炎 鼻窦炎 心内膜炎 败血症 脑膜炎等 及严重的继发感染 杜克雷嗜血杆菌是引起软性下疳的病原菌 本属细菌对营养要求严格 生长时需血液中存在的生长因子 人工培养时必须供给新鲜血液才能生长 故名 嗜血杆菌 2019 2 寄居在人体的嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 H influenzae 副流感嗜血杆菌 H parainfluenza
2、e 溶血嗜血杆菌 H haemolyticus 副溶血嗜血杆菌 H parahaemolyticus 嗜沫嗜血杆菌 H aphrophilus 副嗜沫嗜血杆菌 H paraphrophilus 副溶血嗜沫嗜血杆菌 H paraphrophaemolyticus 惰性嗜血杆菌 H segnis 杜克雷嗜血杆菌 H ducreyi 2019 3 一生物学性状 1 形态与染色 嗜血杆菌包括一群无动力 无芽胞的革兰阴性小杆菌 从病灶中新分离的菌株多呈球杆状 双球状或短链状 在陈旧培养物中呈多形性 长杆状或呈长丝状 直径通常不超过1 m 2019 4 2019 5 2019 6 2019 7 2019
3、8 2 培养特征 嗜血杆菌对营养要求较高 需氧或兼性厌氧 在补充5 10 CO2的大气中生长良好 最适生长温度为35 37 pH7 6 7 8 在pH7 6条件下生长最好 生长需要X因子 V因子或二者之一 X因子是一种对热稳定的血红素及其衍生物 是一种含铁的卟啉 为细菌合成过氧化氢酶 过氧化物酶 细胞色素氧化酶的辅基 V因子是一种对热不稳定的维生素B类物质 是脱氢酶的辅酶 在细胞的呼吸中起递氢的作用 红细胞中富含X及V因子 但羊血红细胞中含有水解V因子的酶类 V因子依赖性的嗜血杆菌通常不能在含有完整红细胞的羊血琼脂上生长 因而实验室中常用巧克力琼脂培养基上分离培养嗜血杆菌 2019 9 3 生
4、化反应 发酵葡萄糖及其他碳水化合物 产酸 少数菌株产气 氧化酶 触酶反应不定 能还原硝酸盐为亚硝酸盐 2019 10 二毒力因子 有荚膜的流感嗜血杆菌根据荚膜多糖抗原可分为a b c d e f6个血清型 其中b型的致病力最强 大部分感染由b血清型引起 b型荚膜物质为线性聚合物 含有核糖 核糖醇和磷酸 或叫作多聚核糖 核糖醇 磷酸 PRP PRP荚膜具有抵抗细胞吞噬及中性粒细胞胞内杀伤的作用 可能是构成b型毒力的重要因素 2019 11 三微生物学检查法 1 标本采集根据不同感染 分别采取血液 脑脊液 鼻咽分泌物 痰液 脓汁等标本 采取标本时应注意下列事项 1 尽量在疾病的早期 用抗生素治疗前
5、 采取标本 采集后应立即送检 2 鼻咽拭子应在取标本前以肉汤湿润拭子 取样后要防止干燥 并立即送检 3 对心内膜炎 菌血症 败血症患者采取血液标本 最好在发热期间多部位 多次采样 4 痰液标本 则首先用灭菌生理盐水将痰液洗3次 然后将痰块打碎 制成悬液 若痰块太硬 可加入等量10g L的胰蛋白酶 于37 水浴0 5 1h 将痰块消化后再接种 2019 12 2 直接涂片检查痰 脓汁 鼻分泌物或溃疡性性病 软性下疳 分泌物可直接涂片 脑脊液须离心后取沉淀物涂片 革兰染色后镜检 查到革兰阴性短小杆菌或多形态杆菌 结合临床症状 可做初步诊断 流感嗜血杆菌还可作荚膜肿胀试验测定其血清型 2019 13
6、 3 嗜血杆菌的分离培养取标本在巧克力琼脂平板上三区划线接种 以保证长出单个菌落 置35 在5 10 CO2的大气中培养24h 2019 14 1 及时处理标本 及时将标本接种到适当的培养基上是提高嗜血杆菌分离率的前提 因为 嗜血杆菌对干燥 对寒冷的抵抗力均较弱 标本在外界环境中暴露时间过长 其存活率降低 不及时接种适当培养基是导致嗜血杆菌分离率低的主要原因 2019 15 2 如何提高嗜血杆菌的分离率 嗜血杆菌分离培养基以巧克力琼脂最好 其中在兔血巧克力琼脂上的生长状况好于羊血巧克力琼脂 如兔血来源困难也可用羊血代替 但需补充一定量的V因子 1 5mg LNAD或2 鲜酵母浸液 在培养基中加
7、入2 鲜酵母浸液和50 鲜牛肉浸液可使菌落明显增大 呼吸道标本中的嗜血杆菌在初代培养时 受到革兰阳性细菌的抑制 营养竞争及菌素作用 菌落细小不易与其他细菌相区别 这是造成嗜血杆菌分离率低的直接原因 在培养基中加入30 50mg L的万古霉素或300mg L杆菌肽 或其他革兰阳性细菌抑制剂 可提高嗜血杆菌分离率 原因是 当在培养基中加入万古霉素后 抑制了革兰阳性细菌的生长 增加了对嗜血杆菌的选择性 嗜血杆菌在加万古霉素的培养基上 菌落生长较大 极易识别 从而提高了嗜血杆菌的分离率 2019 16 1 不同血源对嗜血杆菌的影响 血源GIP 羊血4 3 1 3兔血7 03 1 45 0 001马血6
8、 88 1 53 0 001 2019 17 表1不同营养培养基上的GI值比较 n 10 培养基GI x s t P值 A4 185 1 161B6 286 1 57210 15 0 001 AS2 259 0 734BS5 352 1 53810 56 0 001 AR4 166 1 345BR7 006 1 58113 58 0 001 A 脑心琼脂加入X V因子 B A加入50 鲜牛肉浸液 加入2 的滤菌鲜酵母浸液 AS 脑心琼脂加入5 脱纤维蛋白羊血 BS AS加入50 鲜牛肉浸液 加入2 的滤菌鲜酵母浸液 AR 脑心琼脂加入5 脱纤维蛋白兔血 BR AR加入50 鲜牛肉浸液 加入2
9、的滤菌鲜酵母浸液 2019 18 2 不同温度制备的巧克力平皿对菌落生长的影响 平皿颜色菌落大小 深咖啡色0 8 1 5mm咖啡色带红0 5 0 8mm浅咖啡带红0 5或 0 5mm 2019 19 3 嗜血杆菌的菌落形态 2019 20 流感嗜血杆菌 2019 21 流感嗜血杆菌 2019 22 流感嗜血杆菌 2019 23 流感嗜血杆菌 2019 24 流感嗜血杆菌 2019 25 流感嗜血杆菌 2019 26 流感嗜血杆菌 2019 27 流感嗜血杆菌 2019 28 2019 29 2019 30 流感嗜血杆菌 2019 31 2019 32 副流感嗜血杆菌 2019 33 副流感嗜血
10、杆菌 2019 34 副流感嗜血杆菌 2019 35 副流感嗜血杆菌 2019 36 副流感嗜血杆菌 2019 37 副流感嗜血杆菌 2019 38 副流感嗜血杆菌 2019 39 2019 40 副流感嗜血杆菌 2019 41 副流感嗜血杆菌 2019 42 副流感嗜血杆菌 2019 43 4 流行病学资料 2019 44 表2130名儿童咽部嗜血杆菌分离情况 菌名男童女童合计构成比 流感嗜血杆菌22 32 4 20 29 4 42 32 3 18 3副流感嗜血杆菌79 83 8 65 80 6 144 82 3 62 6溶血嗜血杆菌3 4 4 2 3 2 5 3 8 2 2副溶血嗜血杆菌2
11、1 30 9 18 29 0 39 28 5 16 9 合计125 97 1 105 93 5 230 95 4 100 0 为检出率 2019 45 表3老年人 121名 与儿童 165名 咽部嗜血杆菌分布调查 菌名分离株数构成比 检出率 老年人儿童老年人儿童老年人儿童 流感嗜血杆菌3362 915 42 521 8溶血嗜血杆菌171 03 00 84 2副流感嗜血杆菌7414573 361 961 287 9副溶血嗜血杆菌234622 819 719 027 9 合计10123410010083 598 8 2019 46 5 抑制剂对嗜血杆菌分离率的影响 2019 47 表4325份标本
12、中嗜血杆菌分离率比较 菌种chocchoc VX2P值分离株数 分离株数 流感嗜血杆菌3 0 9 17 5 2 12 07 0 001副流感嗜血杆菌44 13 5 136 51 5 88 17 0 001副溶血嗜血杆菌54 16 6 95 29 2 39 09 0 001溶血嗜血杆菌3 0 9 3 0 9 合计104 32 0 251 77 2 141 24 0 001 2019 48 4 嗜血杆菌的鉴定通过检测嗜血杆菌有无溶血性及其对X V因子的需求情况 即可将嗜血杆菌属中的流感嗜血杆菌 H influenzae 副流感嗜血杆菌 H parainfluenzae 溶血嗜血杆菌 H haemo
13、lyticus 副溶血嗜血杆菌 H parahaemolyticus 嗜沫嗜血杆菌 H aegypticus 及杜克雷嗜血杆菌 H ducreyi 加以区别 2019 49 1 初级鉴定 血琼脂卫星琼脂卫星 溶血 流感嗜血杆菌 溶血嗜血杆菌 其他 2019 50 2 二级鉴定 X因子V因字 溶血 流感嗜血杆菌 溶血嗜血杆菌 杜克嗜血杆菌 副流感嗜血杆菌 副溶血嗜血杆菌 2019 51 3 三级鉴定 生化反应VITEK NHIAPINH注 若是脑脊液标本应作血清分群 2019 52 表5嗜血杆菌属主要菌种鉴别 菌名X因子V因子溶血CO2触酶G C mol 流感嗜血杆菌 39埃及嗜血杆菌 39溶血
14、嗜血杆菌 39嗜沫嗜血杆菌 42杜克雷嗜血 38副溶血嗜血杆菌 40 41副流感嗜血杆菌 DD40 41副嗜沫嗜血杆菌 42 常见在次代培养不需要血红素 D 不同结果 2019 53 5 卫星试验原理 有溶血性的细菌在羊血琼脂培养基上生长时可破坏红细胞释放出血红素 即X因子 和维生素B类物质 即V因子 从而促进了流感嗜血杆菌的生长 金黄色葡萄球菌在生长过程中能合成V因子释放于培养基中 当嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌一起培养时 V因子会促进嗜血杆菌的生长 出现靠近葡萄球菌菌落的嗜血杆菌菌落较大 而远离葡萄球菌菌落的嗜血杆菌菌落较小的现象称为 卫星现象 在不含血红素琼脂平板上进行的卫星试验 称为 琼脂
15、卫星试验 2019 54 2019 55 1 卫星试验 1 点种法 挑取可疑菌落密涂划种于血琼脂平板 卫星试验 和脑心琼脂平板 琼脂卫星试验 上 再将金黄色葡萄球菌点种其上 在5 10 CO2的大气中 35 培养24h 如在金葡菌菌落邻近处被检菌的菌落较大 远离金葡菌菌落处的菌落小或不生长 即 卫星 试验阳性 2019 56 点种法卫星试验结果 2019 57 2019 58 2019 59 2019 60 2019 61 2019 62 2019 63 2019 64 2019 65 2019 66 2019 67 2019 68 2019 69 2019 70 2019 71 2019 7
16、2 2019 73 2019 74 2 纸片法 取0 5 1个麦氏单位的被检菌菌液 涂抹于脑心琼脂平板上 贴X V和X V因子纸片 纸片间距离大于5cm 纸片周围有被检菌生长即为阳性 判断同卫星试验 2019 75 纸片法卫星试验结果 2019 76 2019 77 2019 78 2019 79 2019 80 2019 81 2019 82 2019 83 2019 84 2019 85 2019 86 3 纸片法卫星试验注意事项 A 在脑心琼脂平板上贴X V和X V因子纸片时纸片间距离应大于5cm 因为V因子分子量小 扩散距离远 否则会出现X因子假阳性结果 2019 87 2019 88 2019 89 2019 90 2019 91 2019 92 2019 93 2019 94 2019 95 2019 96 2019 97 2019 98 2019 99 2019 100 2019 101 2019 102 B 如果出现 X V 纸片阴性结果 应考虑以下几个问题 1 细菌死亡 2 培养基营养缺乏 3 纸片失效 2019 103 2019 104 表6不同琼脂上卫星试验结果比
