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1、1芽孢杆菌分离筛选与培养枯草芽饱杆菌是芽饱杆菌属的模式种，很少成链，通常为0.70.8m2.03.0m， 营养细胞杆状，杆端钝圆，单生或成短链，能运动，革兰氏染色一致呈阳性，芽孢中生或偏生，芽孢呈椭圆或长简形。无荚膜，周生或侧生鞭毛，游离孢子表面着色弱， 菌落形态变化较大，粗糙，表面干燥，不透明，灰白色或微带黄色，扩散（蔓延）生长。斜面丰厚粗糙，不透明，蜡质蔓延，奶油色至微褐色。在液体培养基表面形成银白色较厚的具皱纹的菌膜。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，广泛分布在土壤、水体及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。琼脂培养基上的菌落圆或不规则形，表面色暗，变厚和不透明，可起皱，可呈奶油色或褐色，菌落
2、的形状随培养基成分不同而有很大变化。当琼脂培养基表面潮湿时，菌落易于扩散。在琼脂培养基上生长的菌苔在液体中不易扩散。在培养液中生成色暗、皱褶、完整的膜，培养液轻度混浊或不混浊。有氧时生长旺盛，在含有葡萄糖的复杂培养基中可进行厌氧代谢，但其生长和发育都较弱，生长温度最高为 4555，最适为 37。枯草芽孢杆菌生理生化特性：液化明胶 冻化牛乳 还原硝酸盐 不产生吲哚，硫化氢 V-P 反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧。 地 衣 芽 孢 杆 菌 孢 囊 不 膨 大 ， 无 伴 孢 晶 体 ， 中 生 卵 圆 型 芽 孢 ， 周 围 鞭 毛 ，无 荚 膜 。 革 兰 氏 液 染 色 呈 紫
3、 色 阳 性 菌 。 细 胞 大 小 一 般 在0.91.22.23.8 微 米 。 菌 落 呈 灰 白 色 、 边 缘 不 整 齐 的 扁 平 菌 落 。1.样品：外购菌种 商品微生物制剂（固体或液体） 土壤水体或枯枝烂叶，腐烂稻草（记录取样位置 PH 植被情况等） 。 2.菌种分离与纯化2.1培养基2.1.1可溶性淀粉 3g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 3g/L KH2PO41.5g/L K2HPO42g/LMgSO4 0.1g/L PH 7.47.6 （富集用）2.1.2 肉汤（NA）培养基（营养琼脂）：蛋白胨 10g/L 牛肉膏 3-5g/L NaCl5g/L PH7.27.4（保
4、存计数或分离纯化用）2营养琼脂：麦芽汁培养基=1：1 混合使用，菌落不易扩散，形态特征典型2.1.3蛋白胨 10g/L 酵母膏 5g/L 葡萄糖 3.5g/L NaCl5g/L K2HPO4 0.5g/L MgSO4 3g/L MnSO4 25mg/L PH 7.27.4（分离纯化用）2.1.4产淀粉酶菌株筛选培养基：可溶性淀粉 3-5g/L 蛋白胨 10g/L 牛肉膏 3-5g/L NaCl 5g/L PH7.27.4（用于淀粉酶产生菌分离筛选）2.1.5产蛋白酶菌株筛选培养基2.1.5.1酪素培养基：2.1.5.1.1 葡萄糖 1g/L，酵母膏 1g/L，酪素 4-5g/L，K2HPO4
5、1g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L 蒸馏水 1000ml， pH7.0-7.2。另：葡萄糖 0.5g/L，酪素 10g/L，NaCl 5g/L K2HPO4 0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，琼脂 20g/L pH7.2-7.42.1.5.1.2牛肉膏 3g/L或酵母浸粉 5g/L 酪素 10g/L NaCl 4-5g/L PH7.27.4先将酪素用少量 2%氢氧化钠润湿，玻棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热搅拌至完全溶解（10-15min） ，补足 1000mL蒸馏水，加入其他成分，调 PH分装灭菌。2.1.5.1.3酵母膏 0.05g/L 酪素 4
6、g/L KH2PO4 0.36g/L Na2HPO4 1.1g/L MgSO4 0.5g/L NaCl 0.16g/L FeSO4 0.002g/L CaCl2 0.002g/L ZnCl2 0.014g/L pH6.5-7.04酪素母液制备：4g 酪素溶解于 0.1N的 30-35mL的氢氧化钠溶液中，水浴溶解 20min，溶解完毕后加入 60-70热水定溶到 100mL.200mL培养基加 20mL.2.1.5.2 脱脂奶培养基：牛肉膏 3g/L（酵母浸粉 5g/L） 蛋白胨 10g/L NaCl5g/L 脱脂奶粉 10-12g/L，PH7.2（用于蛋白酶产生菌的筛选）将脱脂奶（粉）加水溶
7、解制成 10溶液，于 115加热灭菌 20-30min，与牛膏蛋白胨固体培养基 1：9 混合均匀倒平板。2.1.6纤维素产生菌培养基：CMC-Na2g/L 蛋白胨 10g/L 酵母膏 5g/L NaCl5g/L PH7.2-7.4（用于纤维素产生菌的筛选）2.1.7促芽胞形成培养基：土壤浸出液 1000mL 蛋白胨 5g/L 牛肉膏 6g/L PH7.27.4蛋白胨 1g/L 酵母膏 0.7g/L 葡萄糖 1g/L (NH4)2SO40.2g/L MgSO40.2g/L K2HPO4 1g/L PH7.27.4 （分离纯化用）产芽孢培养基：蛋白胨 10g/L 牛肉膏 3-5g/L NaCl5g
8、/L .玉米粉 0.5g/L 酵母膏 0.1g/L PH7.27.4 2.1.8产蛋白酶发酵培养基： 玉米粉 30g/L 豆饼粉 20g/L 麸皮 10g/L 磷酸二氢钠 4g 磷酸二氢钾30.3g/L 碳酸钠 1.0g/L PH7.47.6 八层纱布塞，牛皮纸扎好。2.1.9产淀粉酶发酵培养基：玉米粉 40g/L 豆饼粉 20g/L 蛋白胨 5g/L 硫酸铵 4g/L 磷酸二氢钠 8g/L 磷酸二氢钾 3g/L PH7.47.6 八层纱布塞，牛皮纸扎好。产酶培养基（蛋白淀粉酶）：蛋白胨 10g/L 酵母膏 5g/L 葡萄糖 1g/L 可溶性淀粉 5g/L 磷酸二氢钾 2g/L MgSO4 0
9、.5g/L CaCl2 0.2g/L PH7.0-7.4 2.2分离纯化（或复壮）2.2.1冻干管的活化及菌种复壮 ：活化：用无菌吸管吸取 0.5mL无菌水滴入安管中，轻荡使干菌体溶解成菌悬液，做梯度稀释后取 0.1-0.2mL涂布或直接划线于肉汤（麦芽汁）培养基平皿，或转接于斜面（活化）37 24-36h。复壮：挑取选择生长快，菌落大的菌落于 4.5mL无菌水试管中，振荡摇匀后置于80水浴加热 15-20min，梯度稀释后涂布于促芽胞形成培养基平皿或蘸取菌悬液直接划线，37 24h。反复二至三次，选取平皿上菌落大而且生长快的菌落转接于斜面 37 18-20h，4冰箱保存。2.2.2商品微生物
10、制剂中菌种选育1g（1mL）商品制剂加入 99mL无菌（生理盐）水/250mL 三角瓶（带玻璃珠） ，置于摇床振荡 20-30min，80-85水浴加热 15-20min，进行梯度稀释成 10-3、10 -4、10-5、10 -6、10 -7，根据活菌含量选取两至三个梯度进行混菌或涂布 35-37 24 h，挑取一环生长快，菌落大的不同典型菌落分别转接 5mL无菌水试管中，混合器混合 5-10min，做成菌悬液梯度稀释后混菌或涂布，或直接蘸取菌悬液直接划线，37 18-20h。结合镜检直到菌落大小基本一致，转接于斜面 37 18-20h，于 4冰箱保存。或将梯度菌液 1mL加入平板，然后分别注
11、入淀粉和酪素培养基中，30-37 24-48h，挑取 D/d大的（淀粉培养基加碘液，观察透明圈）转接于斜面备用或用划线法进行纯化。并通过染色镜检观察，从菌落形态和细胞形态进行鉴别。 2.2.3自然筛选2.2.3.1富集培养：取 5g底泥或肠道内溶物 0.5g，加入 45（50）mL 无菌水/250mL 三角瓶（带玻珠）4中，振荡 15-20min，取 5mL菌悬液或 5mL水样加入 45mL促芽培养基/250mL 三角瓶中，75-80水浴 15-20min，降至 35-37 150-200r/min 振荡 24h，染色镜检，连续两至三次培养备用。或取 1g底泥（土）置于 20mL肉汤培养基/2
12、50mL三角瓶，八层纱布封口，75-80水浴处理 15-20min，然后 150-200r/min振荡 24h。镜检形成芽孢情况，挑取具有芽孢的菌落进行划线纯化培养，获得单菌落。2.2.3.2分离纯化取富集菌液置于 75-80水浴 15-20min，梯度稀释 10-3、10 -4、10 -5、10 -6、10 -7，选择三个合适的梯度混菌或涂布于营养琼脂麦芽汁培养基或直接涂布于酪素培养基上初筛，也可划线分离（划线法先将平板置于 30（24-48 h）或 37（18-24h） ，无菌检查，表面冷凝水干燥） 。每个梯度二个平皿，将平板倒置，于 35-37 24-48h。对长出的单菌落进行编号，选择
13、生长快、菌落大，表面干燥，粗糙，不透明的菌落转接于斜面备。挑取少许菌苔涂片，做芽胞染色判断是否为芽孢杆菌。2.2.3.3菌种筛选：蛋白酶产生菌株筛选：操作程序：样品溶解稀释热处理（75-80）-梯度稀释平板涂布培养单菌落编号（转接斜面）-镜检（涂片芽孢染色）-初筛（点接酪素平板）复筛（接产酶培养基培养，离心取清液蛋白酶活力测定）-转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥 粗糙 不透明，作为目标菌。 以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于酪素平板，35-37 24-48h，菌落周围出现透明圈，挑取 C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。产蛋白酶发酵培养基 35-37
14、振荡培养 24-48h，发酵过滤或离心，取清液检测蛋白酶活力进行复筛。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶的活力有很大差异，有的活力大于4000U/ml。C/H 大菌落，其蛋白酶不一定大，因此，对初筛 C/H大菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活测定进行复筛。 淀粉酶产生菌株筛选：样品溶解稀释热处理（75-80）-梯度稀释平板涂布培养单菌落编号（转接斜面）-镜检（涂片芽孢染色）-初筛（点接淀粉平板-滴加碘液）复筛（接产酶培养基培养，离心取清液淀粉酶活力测定）-转接斜面保藏。一般选择菌株表面干燥 粗糙 不透明，作为目标菌。以判定为芽胞杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔做成菌悬液，划线于或适当稀释涂布于
15、淀粉平板，35-37 24-48h，取 0.02mol/l碘液或卢戈氏碘液滴加在淀粉平板中菌落周围，观察形成透明圈的结果，挑取 C/H大菌，转接于斜面或进行复筛。接入产淀粉酶发酵培养基 35-37 振荡培养 48h，发酵过滤或离心，取清液检测淀粉酶和糖化酶活力进行复筛。菌种鉴定：染色显微镜观察，从细胞形态及菌落特征进行鉴别。菌落扁平，圆形或近圆形，表面粗糙，乳白色。镜检菌体杆状，单个或链状，革兰氏染色阳性，芽孢圆形或柱型，中生或近中生。菌株的糖醇利用，产酸产气，生长温度，酸碱度 PH，耐盐试验（7） ，溶菌酶抗性，V-P 试验，M-R 试验，接触酶反应，吲哚反应，明胶液化，淀粉水解，硝酸盐还原，对氧需求（厌氧生长） ，柠檬酸盐利用，酪素水解，尿素利用等。常见的稀释方法：5培养皿稀释法：5-6 个无菌培养皿，分别滴一滴无菌水或生理盐水，接种环蘸取菌悬液与第一培养皿无菌水混合，在与第二培养皿无菌水混合，依次第三四五六，在各培养皿注入 45-50培养基 12-15mL
