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1、自由基检测方法自由基检测方法 赵宝洪 1，高洪 1* （1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.海关总署缉私局瑞丽缉毒犬基地，云南瑞丽 678600） 摘 要：自由基是含有未成对电子的原子、分子或原子团，它是线粒体在电子传递的过程中产生的，正常情况下，机体的自由基清除系统可使自由基的产生与消除保持在极低的动态平衡水平上，对机体是有利的，但当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，导致动物组织或细胞的氧化，损害细胞膜上的脂类和蛋白质等，从而使细胞膜黏度增加，流动性下降，抗氧化酶丧失活性，造成膜内外离子交换紊乱等，致使细胞内钙离子超载，黄嘌呤氧化酶活性升高，又进一步加速自由基的产
2、生。为提高自由基对动物机体损伤的诊断效率，近年来自由基检测方法在病理学、生物学中发展迅速，并得到了广泛应用。 关键词：自由基；检测方法；概述 自由基(free radicals，FRs)化学反应性极强，极不稳定，半衰期短，其化学反应性的特点是连锁反应，一经启动即可连续发生。从生物学角度讲，通常所说的 FRs 主要是指活性氧 (active oxygen)，即氧的某些代谢产物和一些反应的含氧产物。由于 FRs 具有活泼的化学反应特性，因而在生物体内具有重要的生理及病理功能，具有重要的生物学意义 14。自 1900 年，Gomberg M 首次证实三苯甲基自由基以来，自由基参与生命过程中许多重要的
3、生化反应逐步为人们所认识，特别是随着现代检测分析技术的日新月异，自由基在生物和病理学领域的作用研究迅速发展。而寻求简便、快速、准确、高效的自由基检测方法成为研究自由基生物学作用的关键 5。 与医学密切相关的自由基是氧自由基(oxygen free radical，OFR) ，包括超氧阴离子和羟自由基，大量研究结果表明自由基与许多疾病的发生有着密切的联系，特别是与生物膜损伤的关系更是目前研究的热点 69。自由基已日益受到人们的重视，现将自由基的检测方法介绍如下。 1自由基相关酶的测定 机体内清除自由基的酶系统主要有超氧化物歧化酶(Superoxide dimutase，SOD) 、过氧化氢酶 (
4、catalase ，CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH Px)等酶类组成。在正常情况下，机体代谢过程中产生的超氧阴离子自由基被细胞的 SOD 歧化为 H2O2，后者再由细胞浆的 CAT 和 GSHPx 催化降解为水和氧。 收稿日期：20070430 作者简介：赵宝洪(1982)，男，云南红河州人，硕士研究生，主要从事兽医分子病理学与比较病理学研究。*通讯作者1.1超氧化物歧化酶的测定 SOD 属于金属酶， 分 CuZnSOD、Mn SOD、FeSOD 3 种。由于 SOD 的底物超氧阴离子自由基寿命极短， 目前除了应用脉冲射解技术或快速冰冻结合电
5、子自旋共振(electron spin resonance，ESR)波谱直接获得 SOD 与超氧阴离子自由基反应的动力学信息外， 一般都采用间接的活力测定法来测定 SOD。 下面介绍几种重要的测定方法。 1.1.1邻苯三酚自氧化法国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法(简称 Marklund法)，Marklund 法是采用 420 nm 处光吸收测定。酶活力定义为：在一定条件下1 mL 的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在 420 nm 波长的自氧化速率达 50%的酶量定为 1 个活力单位。顾孔书等对邻笨三酚自氧化法的测定结果影响因素进行了探讨，结果邻苯三酚自氧化法受到溶液的酸碱性、温度、存放时间及邻苯
6、三酚的浓度的影响。 1.1.2亚硝酸盐形成法通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含 SOD 时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝盐减少，比色时测定管的吸光度低于对照管吸光度，通过公式计算可求出被测样品中的 SOD 活力。 1.1.3极谱氧电极法极谱氧电极法利用了系统产生超氧阴离子自由基过程中消耗 O2，一定量的 SOD 又会使超氧阴离子自由基歧化产生 O2，从而使耗氧量减少的特性，使用极谱氧电极仪精确测出耗氧量而推算出酶活力。SOD 活力单位定义为：25 ， p
7、H 8.4，使每分钟产生 1 L O2 的 SOD 量定为 1 个酶活力单位。张继全等在极谱氧电极法测定超氧化物歧化酶活性的改进一文中，对此方法进行了如下修改：室温测定；酶活性用标准 SOD 标定；反应在磷酸盐缓冲液中进行；增大邻苯三酚的用量，从而克服了易在电极薄膜表面产生气泡的问题，测定灵敏度及线性范围增大。 1.2过氧化氢酶的测定 CAT 的作用是降解细胞内的 H2O2。测定 CAT 的方法有滴定法、极谱氧电极法等。高锰酸钾滴定法，其原理是定量的细菌同定量的 H2O2 发生反应，定时加酸终止反应，尔后用高锰酸钾滴定剩余 H2O2 量，从而求得细菌 H2O2 酶的量。唐明忠等在滴定法定量测定
8、细胞菌过氧化氢酶及在肠杆菌科的应用一文中，采用高锰酸钾滴定法定量测细胞过氧化氢酶，结果测得沙雷菌属、变形杆菌属、摩根菌属、耶尔森菌属、哈夫尼亚菌属和产气杆菌的过氧化氢酶活性较高， 普罗菲登菌属、一些沙门菌属、部分肠杆菌属和部分克雷伯菌属的活性居中，埃希菌属、志贺菌属的活性较低。 1.3谷胱甘肽过氧化物酶的测定 GSH Px 是一种含硒酶，主要分布在细胞的胞液及线粒体基质中，测定GSHPx 活力常用的方法是 Hafeman 法及其改良法，可以直接测定酶促反应中GSH 的减少量，以此来计算 GSHPx 的活力单位，还可用偶联法测 GSH Px 活力，但该法对试剂要求较严，难以推广。 2化学发光测定
9、 早在 100 多年之前，Dubois(1885)已提出生物发光是由荧光素酶与荧光素的化学反应引起的。Harvey 经过 40 多年的研究，于 1952 年发表了“ 生物发光”专著。随着生物发光研究的不断深入，发现机体的器官、组织、细胞乃至大分子物质都在发光，不过其发光强度很弱，称之为超弱发光或低水平的化学发光。 化学发光的原理是从一个化学反应(一般是氧化反应)中获得能量，使反应物或产物分子的电子激发，形成电子激发态，当返回基态时，以发射光子的形式释放能量，这一过程称为化学发光(chemiluminescence ，CL) 。因其不需外来光源激发便能发光，特称为化学冷光，可以用发光检测装置定量
10、测定。鲁米诺(luminol,3氨基苯二甲酰肼)及其衍生物，如异鲁水诺，是常用的化学发光剂，在有氧化剂，如氧、H 2O2、阴离子自由基以及其他过氧化物存在下，化学发光剂可以被氧化，产生电子激发态的中间产物，当其返回基态时，即产生化学发光。Allen R C 等(1972) 首先发现了吞噬细胞在其吞噬活动中产生的化学发光现象，自此开创了化学发光分析技术在医学、生物学研究中的新局面。国外学者 Kato T 等早在 1981 年就进行了全血化学发光分析法的研究，发现血液粒细胞在全血化学发光中居首要地位，其次是血小板，井证实环氧酶不参与粒细胞产生的CL，而参与血小板产生的 CL。随后，Heherer
11、M 等应用该方法对急性炎症患者和恶性肿瘤患者的全血进行了化学发光的分析，结果表明，这两组患者的比CL(即每 103 个粒细胞的 CL 活性)均较正常人显著升高，其中急性炎症患者的总 CL 活性高于恶性肿瘤组。Okuda M 等用鲁米诺溶液灌注离体的大鼠心脏和肝脏，以检查缺血再灌注期间心和肝的鲁米诺增强的化学发光强度的变化，结果表明，注入鲁米诺并不影响器官生理参数，但缺血会即刻引起化学发光强度下降，尔后增高，再灌注后使化学发光强度进一步增强，然后逐渐下降。SOD能抑制心脏缺血再灌注期化学发光强度的增高，而 CAT 则不能。对于肝脏，SOD 既能抑制缺血期化学发光强度的增高，也能抑制再灌注期化学发
12、光强度的增强，使肝脏的化学发光强度连续保持在低水平状态，而 CAT 只能抑制再灌注期化学发光强度的增高 1314。 3荧光分光光度法测定自由基的中间产物 不饱和脂肪酸是自由基的易攻目标之一，氧自由基作用于脂质的不饱和脂肪酸，生成过氧化脂质.后者在酸性条件(最适 pH 4.0)，加热分解成丙二醛(malondialdehyde，MDA) ，作为脂质过氧化的次级产物，MDA 再与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)缩合，生成红色产物，然后进行比色，以此来估测样品中过氧化脂质的含量，进而了解体内如某组织，细胞或血清脂质过氧化状况。以上方法称为硫代巴比妥酸法，因为硫代巴比酸具
13、有荧光，故在比色基础上发展成为荧光法，灵敏度提高了 10 倍以上，所需样品量减少，激发波长为515 nm，荧光波长为 553 nm。此法主要用于检测脂质自由基。 4电子自旋共振技术与自旋捕捉法 由于自由基具有生物半衰期极短、在生物体内的浓度很低等特点，故要直接检测它们非常困难。目前只有电子自旋共振(ESR)技术能直接检测到自由基，该技术是最常用、最有效的检测方法，该方法的原理比较复杂，简要地说，因为自由基具有 1 个或 1 个以上不成对的电子，ESR 法就是依赖于样品中存在的未配对电子，其基本概念可用 1 个未配对的电子来描述，即 1 个带电而且自旋的电子犹如一个小磁铁，具有一个磁偶极矩，根据
14、量子力学理论，未配对电子在外磁场只可能有与外磁矩平行与反平行的两种不同取向的磁矩，其相应能量一个为高能级，一个为低能级，当外加一个特定的高额磁场时，低能级的未配对电子则从高频磁场吸收能量跃迁至高能级，这就产生电子能与辐射能场共振，将这种能量吸收变为电信号进行放大检测，则得到 ESR 信号，获得的谱图称为ESR 波谱。测定健康的和患子宫癌的子宫颈和子宫内膜样品的 ESR 波谱表明，正常子宫和内膜的冰冻粉末样品均产生很强的 ESR 信号，而子宫癌样品的相应信号则很弱，甚至不能检出。自从 1954 年美、法学者将 ESR 技术首次引入生物学研究领域以来，ESR 分析方法在生命科学研究中得到了广泛应用
15、，尤其是在氧自由基检测方面多见报道。肖华山等人应用 ESR 和自旋捕捉剂相结合直接测定了过硫酸胺N，N，N，N四甲基二胺(APTEMED)体系产生的氧自由基，经计算机波谱模拟和计算渡谱参数证实该体系产生的氧自由基是超氧阴离子自由基和羟自由基。陈越等 15应用 ESR 技术观察了 Ge132 对机体免疫器官氧自由基含量的影响，证实了 Ge132 能降低健康雏鸡胸腺、法氏囊和脾脏中氧自由基含量，Ge132 是体内氧自由基的清除剂。于玲范等 16在低温下应用 ESR 技术直接检测了大剂量维生素 D2 致大鼠心肌损伤时肌中氧自由基含量变化，并观察到L甲硫氨酸对受损心肌具有保护作用。廖维靖等 17等首次
16、报道了用 ESR 技术检测到坐骨神经受损时氧自由基含量升高。马杰等以家兔为模型，通过 ESR 波谱仪观察到实验动物发生迟发性脑血管痉挛时脑脊髓液中氧自由基含量增高，并且脑脊髓液氧自由基的 ESR 检测结果与脑脊髓液丙二醛(MDA) 含量测定结果之间有高度相关性(r0.88， P0 01)。 5荧光法 Paritam K D 等 18应用荧光法显示了潮藻 chatlonellaanttiqua 产生的 O 。需要荧光探针 3,7dihydro64(2(N(5fluroresceinyl)thioureido)ethory)phenyl2-methylimidazo(1,2a)pyrazin3one(FCLA)作为超氧阴离子自由基和氧自由基的特异性检测试剂，在 20 与潮藻共同孵育 10 min 之后，将之涂于载玻片上，加盖玻片，在氩气激光扫描显微镜下现察发荧光的部位，即超氧阴离子自由基的产生部位。FCLA 在 532 nm 处有一吸收带，氩气激光，48
