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1、无菌检查法验证 张荣玉 一 概述 1 1定义 系用于检查药典要求的无菌的药品 医疗器具 原料 辅料及其它品种是否无菌的一种方法 2 1验证的必要性和意义 确认所采用的方法检查供试品无菌的适合性 保证检查结果的准确性 可靠性 准确性和重现性 检查方法的完整性 与同药品无菌检查接轨 通过对不同品种 批号的无菌检查比较 对产品生产全过程进行质量监控 二 存在问题 2 1专业人才少 缺乏相应的培训和管理 2 2工作量大 导致操作不规范 2 3检验方法缺陷 如直接种法可操作性差 引入污染的风险较大 2 4试验条件的影响环境影响培养基 稀释剂 冲洗液 所用品 器具清洁灭菌 三 无菌检查的试验要求 3 1环
2、境 10000级局部以下100级 布局符合无菌操作要求 或隔离系统 生物安全柜 3 2人员 必须具备微生物专业知识 并经培训 3 3设备 器件 材料 经处理必须符合无菌要求 培养箱的温度指示装置要校验 3 4培养基 3 4 1按药典规定处方配制 采用经验证合格的灭菌程序灭菌 3 4 2保存 2 25 避光保存 期限 非密闭容器3周 密闭容器1年 3 4 3培养基适用性 无菌性 灵敏度检查 3 4 4灵敏度检查 3 4 4 1检查用菌株传代不得超过5代 3 4 4 2常用菌株 金黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 铜像假单胞菌 CMCC B 10104 枯草芽胞杆菌 CMCC B 63501
3、 生孢梭菌 CMCC B 64941 白色念珠菌 CMCC F 98001 黑曲霉 CMCC F 98003 3 4 4 3菌液配制 保存 接种培养按药典要求 3 4 4 4结果判断 空白对照应无细菌增长 加菌液的培养基管均生长良好 培养基灵敏度符合要求 3 5稀释液 冲洗液 3 5 1按药典规定配制后采用经验证的灭菌程序灭菌 3 5 2常用稀释液 冲洗液 0 1 蛋白胨水液PH7 0氯化钠 蛋白胨缓冲液无菌0 1 氯化钠液中性磷酸盐缓冲液含0 1 聚山梨酯 吐温 80 的0 1 蛋白胨水溶液3 5 3依据供试品的特性选择稀释液 冲洗液 四 无菌检查法验证 4 1原理 验证的所有环境 培养基
4、菌株 稀释液 冲洗液均与日常检查方法相一致 并符合相关规定 4 2验证分类 前验证 建立无菌检查方法时 再验证 修订检查方法时 定期验证 供试品组合或原检查条件改变 4 3验证方案制定原则 供试品的抑菌性 敏感菌种选择 适当的方法消除或降低抑菌性 样品的预处理方式能有效抵消 或中和 产品的抑菌性 样品的预处理方式 检验过程 培养条件均不影响样品中微生物的生长 验证记录真实完整地记录所做试验 4 4验证重点环节分布 样品 需前处理 不需前处理 验证前处理方法对污染菌生长 检出影响 有抑菌作用 去除抑菌作用 通过验证实验判 无抑菌作用 验证抑菌活性去除方法的有效性及对污染菌检出物影响 检验 4 5
5、验证方法 4 5 1制备验证试验菌液 按药典方法配制菌液 4 5 2选择配制适合的培养基 稀释液 冲洗液 4 5 3供试品的处理 验证所用的溶解剂 稀释剂 助溶剂 破乳剂等的有效性 使用量及微生物生长无影响 验证加热温度 离心速度和时间对微生物生长或分布无影响 不需前处理的供试品免做 4 5 4无抑菌性样品的验证方法 依据产品溶解性和微生物限度选择合适的中性稀释剂溶解和稀释 用直接接种法验证 常用中性稀释液或淋洗液 4 5 5具有抑菌性样品的验证方法 确定抑菌作用 抑细菌 真菌试验验证 选择敏感菌株对供试品抑菌活性去除效果检验 阳性菌回收试验 消除样品抑菌性的方法验证 化学钝化中和法 化学试剂
6、中合法 利用化学 生物 专属性灭活 常用钝化剂有 对氨基苯甲酸 卵磷脂 聚山梨酯 80等 薄膜过滤法和直接接种法也可用 对化学中和剂不敏感的样品 用酶中和 如 内转氨酶 稀释中和法 利用降低供试品的相对浓度 将样品稀释至最低抑菌浓度下进行 薄膜过滤法 利用体积差异分离 通过薄膜过滤 微生物被截于滤膜 培养薄膜观察有无微生物生长 各方法组合运用 效果更好 验证方法 a 验证分组 A组 样品组 适当方法中和样品 加入少量验证微生物 接种量少于100cfu B组 对照组 0 1 蛋白胨或PH7 0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液 加少量微生物 接种量少于100cfu C组 阳性对照组 不经中和处理 将实验菌株
7、直接接种于培养基中 接种量少于100cfu b 结果分析 A组与B组微生物生长数量相似 表明中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性 如果B组与C组的微生物数量相似 表明样品预处理用中和剂的毒性 检测程序和培养条件等均不影响微生物生长 样品如无抑菌性 省去B组试验 A组与C组直接比较 A组微生物生长数量不及C组微生物生长数量 表明试验用器具材料或培养条件等方面存在对微生物生长不利因素 c 为考查验证方法的稳定性和重现性 验证至少需3个不同批次的同类样品 分别进行3次验证实验 五 供试品无菌检查验证 5 1按药典要求确定检验数量 检验量 设立阳性对照和阴性对照 5 2供试品无菌检查方法和检验条件与
8、验证方法相同 5 3直接接种法验证试验 5 3 1供试品有抑菌时 按培养基灵敏度试验的菌种 向该种无菌检查培养基内加入该微生物 每种培养基接2瓶 每瓶接种量控制10 100cfu之间 5 3 2参照药典规定确定培养基用量 按无菌检查要求向上述其中一瓶加入规定量供试品 另一瓶为阳性对照 5 3 3将种好的容器按药典规定温度培养14days 5 3 4验证结果评价 供试品与阳性对照相比 供试品容器内微生物生长不明显 说明有抑菌性 可使用中和剂如比温 80 内酰胺酶等消除抑菌效果 中和剂不能消除抑菌作用 适当增加培养基体积稀释 5 4薄膜过滤法验证试验 5 4 1薄膜过滤法验证试验供试品有抑菌特性时
9、 在同型号的每个过滤器加规定定量的供试品 容器数及每容器的过滤体积 淋洗至少3次 淋洗液为100ml 次 最后一次淋洗液中 接种验证用菌株 10 100cfu 取另一滤器不过滤供试品 重复上述淋洗操作 作为阳性对照 分别将灵敏度实验的菌种及相应培养基逐一试验 5 4 2供试品和阳性对照接种后 培养基容器按药典菌株要求温度下培养 时间不超过14days 5 4 3使用新的滤膜过滤器 不同厂家或批号 型号 重新进行样品试验组 蛋白胨对照组和阳性对照组的验证确认 5 4 4验证结果评价 供试品培养基容器内可见微生物生长明显 混浊 与阳性对照组比较结果相似 则在无菌检查试验中必须过滤与验证试验相等量的
10、供试品 淋洗液 淋洗相同次数及使用相同量的培养基 供试品培养基容器内与阳性对照结果相比微生物生长不明显 应增加淋洗次数 重复上述试验 六 验证合格标准 6 1平皿菌落计 6 1 1通常用于药品防腐剂防腐效力测试和微生物限度检查中 计数每毫升 或克 样品的微生物含量 6 1 2每种试验菌每组至少重复3次 3个不同批次的样品 6 1 3合格标准 A组 样品试验组 验证微生物平均生长数量不低于C组 阳性对照组 验证微生物平均生长数量的70 检验方法通过验证 6 2直接接种法 6 2 1培养基能中和抗菌剂的抑菌性 并适合广谱微生物的生长 包括样品种潜在微生物生长 6 2 2每种试验菌种每组实验至少独立
11、重复3次 如需要改变产品和培养基比率达到中和效果 6 2 3合格标准 3批 不同批次的样品 在14days内所有样品试验组中培养基都显示大量的微生物生长 则相应的试验方法通过验证 6 3薄膜过滤法 6 3 1适用于无菌检查和生物限度坚查 样品必须能被过滤 需溶解的样品应验证该样品的溶解方式及整个试验过程 试验用具和材料及培养条件等不会影响样品中固有的微生物的生长 6 3 2样品试验组 样品溶液通过薄膜 用适量淋洗液淋洗3次 在最后一次淋洗液中接入少量 10 100财富 验证菌 淋洗后 将滤膜转移到固体培养基 或液体培养基中 培养 样品抑菌性强 则应进行中和处理 再验证中和效果 6 3 3蛋白胨
12、对照组 不加产品的稀释液 其他操作及实验条件与样品试验组相同 验证中和用钝化剂 针对需预处理的样品 过滤器和滤膜材质是否会对微生物产生影响 6 3 4阳性对照组 将与上述两组等量同种验证菌液 10 100cfu 直接种到固体培养基表面 或液体培养基中 比较蛋白胨对照组和阳性对照组微生物的情况 估算滤器和滤膜造成微生物的损失量 6 3 53次试验 3个不同批次的样品 结果评价 上述3组试验结果间差异均在70 以上 固体培养基 或培养14days内所有试验组的液体培养基微生物均有生长 则认为验证微生物的回收率基本相同 相应的微生物验证方法同过验证 七 验证试验结果的评价与报告 7 1分析评价主要包
13、括有 7 1 1对每个验证试验的菌株 每次验证试验的数据及其有效性和合理性评价 7 1 2验证试验数据所表明的检品预处理方式 检验用器具 材料 培养条件等的合理性是否符合规定要求 它们与药品检验的规程要求是否符合 7 1 3验证试验数据最后要说明该药品的微生物检测方法是否准确 有效 可靠与可行 是否有较好的重现性 最后得出结论 7 2验证试验报告内容包括有 7 2 1验证试验药品的名称 待验证检验方法的有效登记号 7 2 2验证试验用菌株名称 菌号 试验室控制号 转种代数 7 2 3验证菌株的制备和接种记录 7 2 4验证供试品的预处理方法 检验用具和材料 检测步骤以及培养条件等 7 2 5验
14、证试验结果的评价及结论 7 2 6验证条件 包括验证试验的原始记录 包括验证菌株的制备和接种量复核 验证试验结果等 无菌验证范例 注射剂无菌检查方法 一 材料 1 1样品 品名 规格 批号 生产批号 1 2培养基稀释液 硫乙醇酸盐液体培养基 批号 改良马丁液体培养液 批号 营养肉汤培养基 批号 营养琼脂培养基 批号 0 1 蛋白胨涤养 PH7 1 0 2 培养基和稀释液来源 1 3验证试验用菌种 所用菌代数 金黄色葡萄球菌 26003 铜绿假单胞菌 10104 枯草芽孢杆菌 63501 生孢梭菌 64941 白色念珠菌 98001 黑曲霉菌 98003 上述菌种的来源及传代数 1 4仪器和滤器
15、 HTY 2001A集菌仪 全封闭无菌试验过滤培养器 批号及生产厂商 二 验证方法 2 1菌液制备 取经34 培养18 24h的金葡萄 铜绿假单胞菌 枯草孢芽菌的新鲜肉汤培养物1ml 加入无菌0 9 氯化钠溶液9ml 10倍稀释至10 5 10 7均为50 100cfu ml 备用 取经34 培养18 24h的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1ml 加入无菌0 9 氯化钠溶液9ml 10倍稀释至10 7均为50 100cfu ml 备用 取经24 培养的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml 加入无菌0 9 氯化钠溶液9ml 10倍稀释至10 7均为50 100cfu ml 备用 取经24 培养一周的
16、黑曲霉料面培养物 加入无菌0 9 氯化钠溶液10ml 洗下孢子 吸出孢子悬液 过滤除去菌籽 收集菌液至另一无菌试管 取菌液0 1ml 加入无菌0 9 氯化钠溶液9 9ml 稀释至10 7均为50 100cfu ml 备用 2 2菌液计数 每种菌液接种工作皿 取平均值 计数结果列表 略 2 3方法验证及结果 直接种法 取样品12支 分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml 支后 再按要求加入相应阳性菌液 30 100cfu ml 置规定温度培养3 5days 逐日观察 记录微生物生长情况 列表 略 薄膜过滤法 取样品1支 将样品过滤于封闭式滤器 3连筒 套 用0 1 蛋白胨氯化钠溶液500ml冲洗后 再分别加入金黄色葡萄球菌 枯草杆菌50 100cfu 筒 同时做平均稀释液对照组 将稀释液对照滤筒和阳性菌的验证过滤筒置于规定温度下培养3 5days 逐日观察 记录微生物生长情况 列表 略 2 4阳性对照 稀释剂 培养液 不加对照菌液 其它操作同前供试品试验 并计数试验菌液的计数 三 结论 选择无菌检查方法 确定阳性对照菌和0 1 蛋白胨水溶液的冲洗量 谢谢
