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1、荧光和化学发光的基本知识荧光和化学发光的基本知识 按光谱分类 狭义 可见光 400 700nm 广义 紫外光 10 400nm 可见光 400 700nm 红外光 700 40000nm 光的基本知识光的基本知识 1 炽热光或白炽光 incandescence 因热而发光 2 气体激发 gas excitation 因电子或热的激发而发光 3 摩擦发光 triboluminescence 4 电激發光 electroluminescence 5 荧光 fluorescence 因光激发而发光 但光源 断后即 再发 光 5 荧光 fluorescence 因光激发而发光 但光源 断后即 再发 光
2、 6 磷光 phosphorescence 因光激发而发光 但光源 断后仍会 持续发光 7 化学发光 chemiluminescence 非生物体把多余的化学能转变 为光能 7 化学发光 chemiluminescence 非生物体把多余的化学能转变 为光能 8 生物发光 bioluminescence 生物体 用化学能发光 发光物质发光物质 荧光物质吸收激发光的能量后 电 子从基态跃迁到激发态 当其回复至基 态时 以发射光形式释放出能量 称为 荧光物质吸收激发光的能量后 电 子从基态跃迁到激发态 当其回复至基 态时 以发射光形式释放出能量 称为 荧光荧光 什么是荧光 一 荧光发生过程一 荧光
3、发生过程 荧光产生于某些分子 通常是含多聚芳香烃的碳 水化合物或杂环化合物 称为荧光体或荧光染料 荧光探针是一个荧光体设计用于定位生物样品的 特异性区域或对特异性刺激因子发生反应 荧光发生是一个3阶段的过程 激发 激发 外源的白炽灯或激光提供的能 量 hvEX 的光子被荧光体吸收 产生被激发的电子单峰态 S1 这个过程是荧光和化学发光的区 别 化学发光的激发态是由化学反 应产生的 激发态的寿命期 激发态的寿命期 激发态存在一个有限的时间 通常是 激发态存在一个有限的时间 通常是1 10 x10 9秒 秒 在这时 间 荧光体经历构象的改变和容易 受到分子环境的相互作用的影响 这些过程有两个重要的
4、结果 第 一 S1 的能量部分被消耗 形成一 个衰减的单峰激发态 S1 即荧光 发射的初始 第二 不是最初被激 发的所有分子都通过荧光发射回到 基态 其他的过程 象振动淬灭 荧光能量传递也在S1 衰减 荧光量 子的产生量 取决于激发的荧光光 子数量与吸收的光子数量的比率 是衡量荧光效率的参数 荧光发射 荧光发射 能量 hvEM 光子被激发 荧 光体回到基态 荧 光体回到基态S0 由于能量在激发 态寿命期的部分消耗 这些光子的 能量较低 因此比激发光子hvEX有 更长的波长 这种由于 hvEM hvEX 呈现的能量或波长的差异称作 Stokes漂移 Stokes 漂移奠定了荧光 技术灵敏性的基础
5、 因为它可以与 激发光子在光谱上分离 而在一个 较低的背景下检测发射光子 相比 较而言 吸收光分光测定法在透射 光检测时相对于较高水平的同一波 长的光 Emission F Excitation 荧光分子受到激发后释放能量的荧光分子受到激发后释放能量的3种方式 发光种方式 发光 Emission Excitation F2F1 Transfer 荧光分子受到激发后释放能量的荧光分子受到激发后释放能量的3种方式 传递种方式 传递 Excitation BHF Transfer 荧光分子受到激发后释放能量的荧光分子受到激发后释放能量的3种方式 发热种方式 发热 二 荧光发射光谱和激发光谱二 荧光发
6、射光谱和激发光谱 发射光谱发射光谱是指固定激发波长 在不同波长下记录 的样品发射荧光的强度 是指固定激发波长 在不同波长下记录 的样品发射荧光的强度 激发光谱激发光谱是指固定检测发射波长 用不同波长的 激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度 是指固定检测发射波长 用不同波长的 激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度 荧光光谱荧光光谱 荧光寿命荧光寿命 定义 荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一 定程度时所用的时间 定义 荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一 定程度时所用的时间 各种荧光物质的荧光寿命不同 各种荧光物质的荧光寿命不同 荧光淬灭荧光淬灭 定义 定义 荧光物质在某些理化因素作用下 发
7、射荧光减弱 甚至消退称为荧光淬灭 如紫外线照射 高 20 苯胺 酚 硝基苯 I 荧光物质在某些理化因素作用下 发射荧光减弱 甚至消退称为荧光淬灭 如紫外线照射 高 20 苯胺 酚 硝基苯 I 等等 三 荧光的性质三 荧光的性质 吸收光吸收光 保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性 荧光波长 激发波长 STOKES 法则 荧光波长 激发波长 STOKES 法则 荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度 有不同程度的衰减有不同程度的衰减 荧光强度取决于激发光强度 被检物浓 度 荧光效率 荧光强度取决于激发光强度 被检物浓 度 荧光效率 四 荧光的产生与分子结构的关系四 荧光的产生与分子结
8、构的关系 1 分子产生荧光必须具备的条件1 分子产生荧光必须具备的条件 1 具有合适的结构 2 具有一定的荧光量子产率 荧光量子产率 吸收的光量子数 发射的光量子数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的 速率常数有关 2 化合物的结构与荧光 1 跃迁类型 的荧光效率高 系间跨越过程的速率 常数小 有利于荧光的产生 2 共轭效应 提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移 3 刚性平面结构 可降低分子振动 减少与溶剂的相互作 用 故具有很强的荧光 如荧光素和酚酞有相似结构 荧光 素有很强的荧光 酚酞却没有 4 取代基效应 芳环 上有供电基 使荧光增 强 五 影响荧光强度的因素五 影响荧光强度的因素
9、影响荧光强度的外部因素 1 溶剂的影响1 溶剂的影响 除一般溶剂效应外 溶剂的极性 氢键 配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化 2 温度的影响2 温度的影响 荧光强度对温度变化敏感 温度增加 外转换去活的几 率增加 3 溶液溶液pH 对酸碱化合物 溶液pH的影响较大 需要严格控制 4 内滤光作用和自吸现象 自吸现象自吸现象 化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端 重叠 产生自吸收 如蒽化合物 内滤光作用内滤光作用 溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧光 如色胺 酸中的重铬酸钾 5 溶液荧光的猝灭 碰撞猝灭 碰撞猝灭 氧的熄灭作用等氧的熄灭作用等 荧光物质荧光物质最大吸收光
10、谱最大吸收光谱最大发射光谱最大发射光谱应用应用 异硫氰酸荧光素 FITC 异硫氰酸荧光素 FITC 490 495nm490 495nm520 530nm 黄绿色 520 530nm 黄绿色 FAT 荧光偏振免疫测定FAT 荧光偏振免疫测定 四乙基罗丹明 RB200 四乙基罗丹明 RB200 570 575nm570 575nm595 600nm 橙红色 595 600nm 橙红色 FITC的衬比染色或双标 记FAT FITC的衬比染色或双标 记FAT 四甲基异硫氰酸罗丹 明 TRITC 四甲基异硫氰酸罗丹 明 TRITC 550nm550nm620nm 橙红色 620nm 橙红色 FITC的
11、衬比染色或双标 记FAT FITC的衬比染色或双标 记FAT 藻红蛋白 PE 藻红蛋白 PE 490 560nm490 560nm595nm 红色 595nm 红色 双标记FAT 流式细胞术双标记FAT 流式细胞术 7 氨基 4 甲基香豆素7 氨基 4 甲基香豆素354nm354nm430nm 蓝色 430nm 蓝色 双标记或多标记FAT双标记或多标记FAT EuEu3 3 螯合物 螯合物340nm340nm613nm613nm时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定 荧光物质荧光物质是一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质 常用的荧光物质常用的荧光物质 六 荧光物质六 荧光物质 七 荧光检测
12、七 荧光检测 荧光检测仪器荧光检测仪器 荧光检测系统的4个基本要素是 激发光源 荧光体 将激发光 子与发射光子分离的特定波长的滤光片 检测器记录发射光子并输出 通常是电子信号或图像 3种主要的荧光检测仪器提供不同的数据 荧光分光光度计 测定液体样品 uL mL 荧光显微镜荧光显微镜 解析荧光作为二维或三维空间位置定位功能 流式细胞仪 测定流体中每个细胞的荧光 在大量样品中进行分选并识别 和定量 激光扫描仪激光扫描仪 荧光信号荧光信号 荧光强度的定量取决于这些参数 吸光度 光径 和稀释浓度 染料的荧光量子的产量 激发光源强度 和仪器荧光采集效率 吸光度 光径 和稀释浓度 染料的荧光量子的产量 激
13、发光源强度 和仪器荧光采集效率 在稀释溶液或悬液中 荧光强 度与这些参数成线性比例关系 某些荧光物质 例如Luminol C8H7N3O2 可將化学反应中产生的能 量 转化成使分子內的电子由基态 ground state 跃升到激发态 excited state 处于激发态的分子并不穩定 將能量以光的形式释放出來 有的 光波长为可见光范围 但占多数的是荧光 fluorescence 化学发光化学发光 化学发光的原理化学发光的原理 1 X光片压片 传统方法 但曝光时间需要摸索 压片法有一定不便 定量也不准 2 扫描仪 一定波长范围扫描 3 成像仪 Cooled CCD 4 荧光化学发光酶标仪 化
14、学发光检测方法化学发光检测方法 杂交检测中的信号物质 非放射性标记 1 核酸杂交 Southern Northern Blot 2 蛋白印迹 Western Blot 3 酶联免疫 Elisa 4 其他 dot slot杂交 原位杂交 噬菌体文库筛选 菌落文库 质粒文库 筛选 化学发光在生物学检测中的应用化学发光在生物学检测中的应用 Luminol 430nm CSPD 发光最强最持久 发光最强最持久 CDP Star 460nm 蓝光 蓝光 Sapphire II 发光增强剂发光增强剂 Emerald II 发光增强剂发光增强剂 注 一般的试剂盒中已将发 光底物与发光增强剂预 先混合为发光底物 注 一般的试剂盒中已将发 光底物与发光增强剂预 先混合为发光底物 Luminol 几种常用的发光底物及增强剂几种常用的发光底物及增强剂
