《血液学第四章第二节第三节PPT课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《血液学第四章第二节第三节PPT课件（89页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二节细胞化学染色检验 细胞化学染色是细胞学和化学相结合而形成的一门科学 它以细胞形态学为基础 结合运用化学反应的原理对血细胞内的各种化学物质 酶类 脂类 糖类 铁 蛋白质 核酸等 作定性 定位 半定量分析的方法 细胞化学染色临床上用于 辅助判断急性白血病的细胞类型 因为不同细胞系列 其所含的化学物质成分 分布及含量各有不同 且随着细胞的逐渐成熟 化学物质的含量等发生相应的变化 因此根据细胞化学染色结果的不同 可推断所属的细胞系列 如过氧化物酶染色 非特异性酯酶染色 特异性酯酶染色等 故临床上急性白血病细胞类型的判断需要结合细胞化学染色 辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断 因为血细胞在病理情况
2、下 其化学物质成分及含量会发生改变 以辅助疾病的诊断 如中性粒细胞碱性磷酸酶染色 铁染色等 观察疾病疗效和预后 发病机制的探讨 所以 细胞化学染色是诊断血液系统等疾病不可缺少的手段 不同细胞化学染色 染色步骤不同 但基本步骤为固定 显示及复染 1 固定为了保持细胞结构及化学成分的不变 需对细胞进行固定 根据染色的成分不同 选择合适的固定液 使细胞内的蛋白质 酶类 糖类等变成不溶性物质 固定的方法有物理法和化学法固定 临床上常用的是化学法固定 物理法包括干燥和火焰固定 化学法包括甲醛 乙醇 甲醇 丙酮等固定 分为蒸气固定和液体固定 1 蒸气固定 甲醛是一种常用的固定剂 甲醛极易挥发 氧化 故常用
3、40 甲醛进行蒸气固定 即在较封闭的玻璃器皿中加入40 甲醛 将涂片血膜朝下 固定5 10min 2 液体固定 将涂片浸在甲醛 乙醇 甲醇 丙酮等固定液中 也可用两种或两种以上固定液混合面成 如10 甲醛甲醇液 甲醛丙酮液等 2 显示通过不同化学反应 最终形成稳定的有色沉淀 显示出被检测的化学物质 常用的化学反应种类有以下几种 1 偶氮偶联法 含萘酚的底物 在相应酶的作用下释放出萘粉 萘粉与重氮盐结合 偶氮偶联形成有色沉演 重氮盐的种类有坚牢蓝紫酱GBC 坚牢蓝B 六偶氮付品红等 如中性粒细胞碱性磷酸酶染色 特异性酯酶染色 非特异性酯酶染色 酸性磷酸酶染色等 2 联苯胺法 粒细胞和单核细胞中的
4、过氧化物酶 能分解过氧化氢释放出新生态氧 使无色的联苯胺氧化形成有色沉淀 如过氧化物酶染色 3 普鲁士蓝反应 细胞内 外的铁与酸性亚铁氰化钾作用 形成如亚铁氰化钾蓝色沉淀 如铁染色 4 雪夫反应 过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基 醛基与雪夫试剂作用 使无色品红形成红色沉淀物 如过碘酸 雪夫反应 5 金属沉淀法 金属及其化合物一般都有颜色 故形成的沉淀物为有色物质 如钙钴法中性粒细胞碱性磷酸酶染色 3 复染复染的目的在于使各种细胞能显示出来以便于观察 选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度 既能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果 如铁染色复染常用中性红 过碘酸 雪
5、夫反应常用甲基绿 对核着色效果较好的有中性红 甲基绿 苏木精 核固红 沙黄等 使浆着色较好的有伊红 刚果红 光绿等 复染后 首先要通过显微镜观察染色是否成功 如过氧化物酶染色 碘酸 雪夫反应等可观察中性成熟粒细胞是否呈强阳性 然后观察相应细胞的染色结果并报告结果 结果的报告一般包括阳性率 积分或阳性分布情况 细胞化学染色的种类有很多 下面介绍过氧化物酶染色 苏丹黑染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 酸性磷酸酶染色 铁染色及酯酶染色 酯酶有多种 根据PH不同分为酸性 中性和碱性酯酶 根据酯酶特异性高低分为特异性酯酶和非特异性酯酶 非特异性酯酶包括酸性非特异性酯酶 即酸性a 醋酸蔡酚酯酶 碱性非特异性
6、酯酶 即a 丁酸蔡酚酯酶 和中性非特异性酯酶 后者包括a 醋酸萘酚酯酶 醋酸AS D萘酚酯酶等 下面逐项介绍各种细胞化学染色 一 过氧化物酶染色 原理 过氧化物酶 peroxidase POX 染色方法有Washburn法 四甲基联苯胺法和改良的Pereira染色法等 前者曾是最为常用的方法 但由于其底物联苯胺具有致癌性 故现常用后两者 下面分别介绍这两种方法的原理 四甲基联苯胺法粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有过氧化物酶 POX能分解H2O2而释放出新生氧 使四甲基联苯胺氧化成联苯胺蓝 后者与亚硝基铁氰化钠结合 再进一步氧化形成稳定的蓝色物质 沉淀于酶活性的细胞质内 改良的Pereir
7、a染色法粒细胞和部分单核细胞中POX能分解H2O2而释放出新生氧 使碘化钾氧化生成碘 碘再与煌焦油蓝作用形成蓝绿色沉淀 定位于酶活性的细胞质内 正常血细胞的染色反应 1 粒细胞系统分化差的原粒细胞为阴性 分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞均呈阳性 且随着细胞的成熟 阳性反应的程度逐渐增强 中性分叶核粒细胞为强阳性反应 但衰老的粒细胞阳性程度减弱甚至呈阴性 嗜酸性粒细胞阳性最强 其阳性颗粒粗大 有折光性 嗜碱性粒细胞为阴性 2 单核细胞系统大多数单核细胞系统的细胞呈阴性或弱阳性 阳性颗粒少而细小 3 其他细胞淋巴细胞系统 红细胞系统及巨核细胞系统的细胞均呈阴性 浆细胞 组织细胞也呈阴性 吞噬细胞有
8、的呈阳性 临床评价 POX染色是临床上辅助判断急性白血病细胞类型首选 最重要的细胞化学染色 但在观察要辨认的细胞POX染色结果前 首先要注意观察成熟粒细胞是否呈强阳性 以判断染色是否成功 1 帮助鉴别急性白血病的类型 1 急性粒细胞白血病 白血病性原始粒细胞可呈阳性反应 阳性颗粒一般较多 较粗大 常呈局限性分布 但阴性时也不能排除本病 急性淋巴细胞白血病时 原始淋巴细胞和幼稚淋巴细胞均呈阴性反应 但可有少许阳性细胞 此系残留的原粒细胞 故FAB分型规定急性淋巴细胞白血病其阳性率 3 急性单核细胞白血病时 白血病原始单核细胞呈阴性反应 有时虽少数可呈弱阳性反应 但阳性颗粒少而细小 常弥散分布 2
9、 小型原始粒细胞和原始淋巴细胞不易区别 如果小型原始细胞呈过氧化物酶阳性反应 可确定为小型原始粒细胞 3 急性早幼粒细胞白血病有时需与急性单核细胞白血病鉴别 如果白血病细胞呈过氧化物酶强阳性反应 应确定为急性早幼粒细胞白血病 4 急性单核细胞白血病有时需与组织细胞白血病和恶性组织细胞病相鉴别 异常组织细胞的过氧化物酶呈阴性反应 而白血病性幼单核细胞和单核细胞呈弱阳性反应 2 成熟中性粒细胞过氧化物酶活性的变化 1 活性增高 可见于再生障碍性贫血 感染 特别是化脓性细菌感染 急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病 2 活性减低 可见于急性粒细胞白血病 慢性粒细胞白血病 急性单核细胞白血病 骨髓增
10、生异常综合征 放射病及退化性中性粒细胞 二 苏丹黑染色 原理 苏丹黑 SudanblackB SBB 是一种脂溶性重氮染料 能溶解于细胞内的含脂结构 如中性脂肪 磷脂 糖脂和类固醇 中 而使脂类物质显示出来 呈棕黑色或深黑色 脂类物质在粒细胞中丰富 单核细胞中也有少量 正常血细胞的染色反应 苏丹黑阳性反应的细胞类型 反应强度与POX基本一致 1 粒细胞系统分化差的原粒细胞为阴性 分化好的原粒细胞至中性成熟粒细胞均为阳性 且随着细胞的成熟阳性程度逐渐增强 2 单核细胞系统呈阴性或弱阳性 3 其他细胞淋巴细胞系统 红细胞系统及巨核细胞系统的细胞均呈阴性 浆细胞 组织细胞也呈阴性 吞噬细胞有的呈阳性
11、 临床评价 本染色临床意义与POX染色基本相似 两者是同一类细胞化学染色 但POX染色的特异性高于SBB染色 极少数急性淋巴细胞白血病SBB染色可阳性 而SBB染色的敏感性高于POX染色 急性粒细胞白血病POX染色阴性者其SBB染色可阳性 并且SBB染色较繁琐 所以临床上常首选POX染色 当POX染色阴性者可再加作SBB染色 SBB染色可用陈旧的涂片 而POX染色要求涂片新鲜 三 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 原理 中性粒细胞碱性磷酸酶 neutrophilicalkalinephosphatase NAP 染色的方法有Gomori钙 钴法和Kaplow偶氮偶联法 因为钙 钴法操作较为繁琐且所需时
12、间长 而偶氮偶联法的试剂盒操作方便 染色时间短 故目前国内常用偶氮偶联法 偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在PH9 6左右的碱性环境中 能水解基质液中的磷酸萘酚钠底物 释放出萘酚 后者与重氮盐偶联 生成不溶性的有色沉淀 定位于细胞质酶活性所在之处 不同的底物与重氮盐的组合不同 化学反应过程以a 醋酸萘酚钠为例 图4 1 正常血细胞的染色反应 1 NAP主要存在于中性成熟粒细胞 包括中性杆状核粒细胞和分叶核粒细胞 故呈阳性反应 其他细胞基本呈阴性 2 成熟中性细胞碱性磷酸酶积分值的计算 在油镜下 计数100个成熟中性粒细胞 包括中性分叶核粒细胞和中性杆状核粒细胞 分别记录其分级情况 全部阳性反
13、应的细胞之和阳性率 将所有的阳性反应细胞均以 级表示后 计算其总积分值 参考值 NAP的积分值为35 70分 各单位应建立本实验室参考值 临床评价 临床上NAP染色应用较广泛 但由于每个观察者的记分标准有所不同 易受主观因素影响 因此参考值范围较大 所以NAP积分明显增高或明显减低 其临床意义较大 同时要排除生理影响 1 生理性变化 1 年龄变化 新生儿活性增加 以后下降 儿童各年龄大致相似 成人较儿童活性减低 老年期更低 2 应激状态下的变化 紧张 恐怖 激烈运动等NAP活性可增加 3 月经周期中的变化 经前期增高 行经后降低 经后期恢复 4 妊娠期的变化 妊娠2 3个月的NAP积分值轻度增
14、高 以后逐月增高 分娩时达高峰 产后则恢复正常 2 病理性变化 1 NAP积分增加 见于细菌性感染 再障 某些骨髓增殖性疾病 如慢粒 骨髓纤维化 真性红细胞增多症 原发性血小板增多症 急淋 慢淋 恶性淋巴瘤 骨髓转移癌 肾上腺糖皮质激素及雄激素治疗后 2 NAP积分下降 慢粒 慢性期 NPN MDS 恶组等 3 疾病的鉴别 1 类白血病反应与慢粒 前者明显增加 后者明显下降且常为零分 2 慢性粒细胞白血病 慢性期 与慢性中性粒细胞白血病 前者明显下降 后者明显增加 常在300分以上 3 细菌性感染与病毒性感染 前者明显增加 尤其是化脓性感染 后者常无明显变化 4 再障与NPN 前者常增加 后者
15、常下降 5 急性白血病类型的鉴别 急粒常下降 急淋常增加 急单不一定 6 恶性淋巴瘤与恶组 前者常增加 后者常下降 7 恶组与反应性组织细胞增多症 前者常下降 后者无明显变化 8 真性红细胞增多症与继发性红细胞增多症 前者常增加 后者无明显变化 9 原发性PC增多症与继发性PC增多症 前者常增加 后者无明显变化 四 酸性磷酸酶染色 ACP 五 过碘酸 雪夫反应 原理 过碘酸是氧化剂 使含有乙二醇基 CHOH CHOH 的多糖类物质 糖原 粘多糖 粘蛋白 糖蛋白及糖脂等 氧化 形成双醛基 CHO CHO 醛基与雪夫试剂中的无色品红结合 使无色的品红变成紫红色化合物 定位于含有多糖类的细胞内 过碘
16、酸 雪夫反应 periodicacid Schiffreaction PAS 以前又称为糖原染色 PAS化学反应过程见图4 2 正常血细胞的染色反应 1 粒细胞系统分化差的原粒细胞为阴性 分化好的原粒细胞至中性分叶核粒细胞均呈阳性反应 并随着细胞的成熟 阳性反应程度逐渐增强 阳性呈细颗粒 均匀红色 嗜酸性粒细胞中的嗜酸性颗粒本身不着色 而颗粒之间的胞质呈红色 嗜碱性粒细胞中的嗜碱性颗粒呈阳性 而颗粒之间的细胞不着色 2 红细胞系统幼红细胞及红细胞均呈阴性 3 单核细胞系统分化差的原单细胞呈阴性 其他为阳性 绝大多数阳性呈细颗粒状 有时分布于细胞边缘的阳性颗粒较粗大 4 淋巴细胞系统大多数淋巴细胞系统的细胞呈阴性 少数淋巴细胞呈阳性 阳性率常小于0 20 阳性呈粗颗粒状或块状 5 巨核细胞系统巨核细胞系统的细胞 包括血小板 呈阳性 阳性呈颗粒状或块状 6 其他细胞浆细胞一般呈阴性 少数呈阳性 呈细颗粒状 巨噬细胞可为阳性 呈细颗粒状 临床评价 1 红细胞系统疾病红血病 红白血病 骨髓增生异常综合征中幼红细胞可阳性 呈均匀红色或块状 有时幼红细胞阳性反应强且阳性率高 甚至红细胞也呈阳性 在
