新一代测序技术的发展现状

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1、 新一代测序技术的发展现状新一代测序技术的发展现状 一 我们将如何应对海量的基因信息一 我们将如何应对海量的基因信息 新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时 却成为限制其广泛应用的一个新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时 却成为限制其广泛应用的一个 障碍 障碍 1980 年 英国生物化学家 Frederick Sanger 与美国生物化学家 Walter Gilbert 建立 了 DNA 测序技术并获得诺贝尔化学奖 至今已有近三十年了 在这三十年 DNA 测序技术取得了令人瞩目的进展 目前已进入市场的循环阵列测序平台采用的是 与 Sanger 生物化学测序方法完全不同的原理 在过去几年

2、应用极为广泛的毛 细管电泳测序法采用的则是多线并行阵列格式 它运用尖端的荧光成像技术进行 碱基识别 上述各类新技术为生物学研究领域开辟了新的视角 也使实验研究达 到一个新的水平 学界对开发这类新技术的兴趣持续高涨 与此同时 人们却发 现这些技术存在一定的不足 大量信息数据的产生限制了技术更加广泛的应 用 并降低了其市场价值 过去 研究人员使用 Applied Biosystems ABI 公司的 3730XL 毛细管电泳测序 仪进行基因分析 每年至多能完成六千万碱基的测序量 随着测序技术日新月异 的发展 这种情况已经成为历史 在 2005 年刚刚开始进行新一代测序技术开发 时 Roche 公司

3、和 454 公司联合开发的焦磷酸测序仪的分析速度就已经达到了上 述提及的 ABI 仪器速度的 50 倍之上 也就是从那时起 因基因数据过多而产生 的问题凸显了出来 而且这个问题随着其他制造商开发出更多更快的测序仪而愈 加严重 举个例子 ABI 的新一代测序平台 SOLiD supported oligonucleotide ligation and detection 单次运行 便可以分析 6Gb 的碱基序列 而 Roche 454 测 序仪单次运行可以将上述结果转换成 12 15 个千兆字节 gigabytes 的数据信息 Illumina Genome Analyzer GAII 测序系统

4、仅在两个小时的运行时间里 就得到 10 兆兆字节 terabytes 的信息 尽管对于像 Applied Biosystems 这样的制造商 而言 可以为用户提供高达 11 25TB 的存储量 但对于多数实验室所具有的信息 管理系统来说 规模如此庞大的数据信息 就好像是迎面而来的洪水 让人感到 难以控制 过量信息所带来的一个副作用在于 用户无法将初始图像数据进行分类存档 而 必须交给相关公司 利用软件对数据进行读取 然后才能对数据进行保存 对于 大多数研究人员来说 像这样在每次实验后对原始数据进行处理的方式既繁琐又 不经济 与花费上万美元对每一段序列进行备份分析相比 对每一次测序结果进 行重新

5、测定显然是一个更简单 更便宜的选择 测序仪制造商称 对原始数据再 次进行分析并不能得到更多新的信息 但是 对于 454 测序仪而言 用户至少可 以通过更新的软件从原始数据得到质量更高的序列 从而提高碱基识别分辨率 减少误差 除数据处理问题之外 研究人员还需要拥有一个足够强大的计算机平台 以便将 来自多个测序技术的短小基因片段进行组合 形成基因组外显子 目前问题在 于 测序仪生产商仅仅提供用于某些特定基因信息分析的软件 如靶标重测序 基因表达分析 染色质免疫沉淀反应或基因组从头测序等 而并未提供任何其它 类型的下游生物学信息分析软件 研究界越来越熟悉这些测序平台对循证生物学 的巨大潜力 这也就产

6、生了新的研究问题以及全新类型的试验方法 而这单凭依 赖目前的生物学信息是无法满足的 从这个角度看 SOLiD 软件研发公司 七月刚刚兼并了两个新的软件公司 这一举动无疑朝正确的方向迈进了一步 该 公司在开放源码许可证下开发软件分析工具 目的就是为了给生物信息学领域提 供支持 并为其开发新的算法 对用户而言 如果能够将数据格式与不同测序平台获得的结果进行比较所得的统 计数字进行标准化 无疑具有重大的意义 特别是由于目前以测序平台为核心的 市场竞争激烈 因此每个生产商都努力提供最好的数据结果 在这样的大环境下 对数据及不同产品的比较结果进行标准化 便显得尤为重 要 有一个方法可以更好地对不同的新一

7、代测序技术进行比较 那就是建立一个 微阵列定性分析小组 Microarray Quality Control consortium 不仅可以对不同 的技术结果进行比较 而且还可以将新技术结果与 DNA 微阵列或定量 PCR 进行 比较 综合以上各类因素 可以预见的是 新一代测序平台在近几年内 仍然会局限于 少数实验室及研究者 而大多数缺少能够对基因信息进行进一步分析的实验室则 无法从新测序技术中获益 对大多数实验室而言 即使新一代的测序平台能够提 供更多的信息 DNA 微阵列分析仍然是一个相对便宜的选择 例如 在转录分 析中 虽然新一代测序结果不仅能给出具有很大动态范围的基因丰度信息 同时 还

8、可提供剪切变异信息以及 SNP 数据 但是这些数据结果都需要进行不同的 DNA 微阵列分析才能获得 那么 有没有什么方法可以解决这些问题呢 首先 相关的资金授予机构应该对 生物信息学的发展予以与测序技术同等的关注 此外 由于生物信息学发展中的 瓶颈已经限制了测序机器的销售 测序仪生产商也应该联合起来解决这一难题 同时 制造商应该致力于制定以研究领域为基础而不是以不同公司为基础的生物 信息学解决方案 因此 如果新一代测序平台真的能够带动基因组测序 普及化 让基因组测序 从大型测序中心走入每个研究人员的实验室或者小型研究小组 那么还需要研究 人员付出更多努力 开发出经济实惠的分析软件以及数据管理系

9、统 目前的状况 是 与新一代测序技术相关的生物信息学分析工作仅仅掌握在少数人手里 但是 这一具有重要价值的技术毫无疑问应该由大多数人掌握 如果数据处理问题不能 得到有效解决 那么 ABI 公司的 SOLiD 系统 454 公司的超高通量基因组测序 系统 GS FLX Illumina 公司的 GAII 系统等新一代测序仪就永远无法真正出 现在能够展现其价值的舞台上 原文检索 Editorial 2008 Prepare for the deluge Nature Biotechnology 26 10 1099 二 传统的二 传统的 DNA 测序技术测序技术 Sanger 测序法测序法 自上世

10、纪 90 年代初 所有的 DNA 测序操作几乎无一例外地全部采用半自动化 毛细管电泳 Sanger 测序法 图 1a 而后来出现的高通量测序方法则首先采用 以下两种方法中的一种对 DNA 进行预处理 表 1 无论采用以上哪种方法处理后 我们均可以得到大量的待测序模板片段 质粒 或 PCR 产物 随后 测序仪会进行 循环测序 反应 在每一轮测序反应的引物 延伸步骤中 会随机引入已被四种不同颜色荧光分别标记的 ddNTP ddATP ddTTP ddGTP ddCTP 以终止延伸反应 这样就形成了大量末端被荧光标记 的 长短不一 终止位点不同 的延伸产物 接着 再用高分辨率的毛细管凝胶 电泳分离这

11、些延伸产物 通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分 计算机 软件会自动 读出 DNA 序列 不过 该方法在 读取 每一个碱基信息时都有可 能出错 后续操作中 比如基因组组装或者找出变异位点等就是具体情况具体解 决了 一般 这种高通量测序仪一次最多只能同时进行 96 个或 384 个样品测序 Sanger DNA 测序技术经过了 30 年的不断发展与完善 现在已经可以对长达 1 000bp 的 DNA 片段进行测序了 而且对每一个碱基的读取准确率高达 99 999 在高通量基因组鸟枪法测序操作当中 使用 Sanger 测序法的费用大约 为 0 5 美元 1 000 个碱基 原文检索 Jay S

12、hendure Hanlee Ji 2008 Next generation DNA sequencing Nature Biotechnology 26 10 1135 1145 三 新一代三 新一代 DNA 测序技术测序技术 DNA 测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域 很多生物学问题都可以借测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域 很多生物学问题都可以借 助高通量助高通量 DNA 测序技术予以解决 过去三年 大规模平行测序平台 测序技术予以解决 过去三年 大规模平行测序平台 massively parallel DNA sequencing platform 已经发展为主流的测序技术

13、 这项测 已经发展为主流的测序技术 这项测序技术序技术 的出现不仅令的出现不仅令 DNA 测序费用降到了以前的百分之一 还让基因组测序这项以前测序费用降到了以前的百分之一 还让基因组测序这项以前 专属于大型测序中心的专属于大型测序中心的 特权特权 能够被众多研究人员分享 目前 新的测序技术能够被众多研究人员分享 目前 新的测序技术 及手段还在不断涌现 比如最新的进展就包括建立序列数据库 建立序列数据及手段还在不断涌现 比如最新的进展就包括建立序列数据库 建立序列数据 分析新方法以及设计测序试验等等 新一代分析新方法以及设计测序试验等等 新一代 DNA 测序技术有助于人们以更低廉测序技术有助于人

14、们以更低廉 的价格 更全面 更深入地分析基因组 转录组及蛋白质之间交互作用组的各的价格 更全面 更深入地分析基因组 转录组及蛋白质之间交互作用组的各 项数据 今后 各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段 这有望给生物项数据 今后 各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段 这有望给生物 学和生物医学研究领域带来革命性的变革 学和生物医学研究领域带来革命性的变革 DNA 测序技术经历了漫长而曲折的发展历程 迄今为止 我们获得的绝大部分 DNA 序列都是基于 Sanger 测序法获得的 在过去 5 年间 人们至少从以下四个 方面刺激了 DNA 测序技术的发展 表 2 1 具有代表性的新一代具有代表

15、性的新一代 DNA 测序仪测序仪 最近市面上出现了很多新一代测序仪产品 例如美国 Roche Applied Science 公司 的 454 基因组测序仪 美国 Illumina 公司和英国 Solexa technology 公司合作开发 的 Illumina测序仪 美国Applied Biosystems 公司的SOLiD测序仪 Dover Harvard 公司的 Polonator 测序仪以及美国 Helicos 公司的 HeliScope 单分子测序仪 所有 这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略 循环芯片测序法 cyclic array sequencing 也可将其称为 新一代测

16、序技术或者第二代测序技术 所谓循环芯片测序法 简言之就是对布满 DNA 样品的芯片重复进行基于 DNA 的聚合酶反应 模板变性 引物退火杂交及延伸 以及荧光序列读取反应 2005 年 有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍 与传统测序法相比 循环芯片测 序法具有操作更简易 费用更低廉的优势 于是很快就获得了广泛的应用 虽然这些新一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序方法有很 大的不同 而且各有特点 表 3 但实际上它们背后的原理和技术都是非常相 似甚至是相同的 图 1b 新一代测序法首先也是将基因组 DNA 随机切割成小 片段 DNA 分子 然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库 也 可以使用配对标签 mate paired tag 制成跨步文库 jumping libraries 随后可 以通过原位 polony in situ polony 小词典 1 微乳液 PCR emulsion PCR 或桥式 PCR bridge PCR 图 5 等方法获得测序模板 上述方法有一个共同点 那就是任何一个小片段 DNA 分子的 PCR 扩增产物都是 在空间上聚集的 原位