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1、第十章白细胞检验的基本方法 第一节白细胞功能检验 一 墨汁吞噬试验二 白细胞吞噬功能试验三 血清溶菌酶活性试验四 硝基四氮唑蓝还原试验五 白细胞趋化性试验六 吞噬细胞吞噬功能试验 第一节 一 墨汁吞噬试验 原理 血液中中性粒细胞及单核细胞对细菌 异物等具有吞噬作用 在一定量的肝素抗凝血中 加人一定量的墨汁 经37 温育4小时 涂片染色镜下观察吞噬细胞对墨汁的吞噬情况 并计算吞噬率及吞噬指数 参考值 成熟中性粒细胞吞噬率74 15 吞噬指数126 60 成熟单核细胞吞噬率95 15 吞噬指数313 86 下一页 第一节 第一节 临床评价 粒细胞的吞噬功能仅限于成熟阶段 单核细胞幼稚型和成熟型都具
2、有吞噬能力 急性单核细胞白血病M5a为弱阳性 M5b吞噬指数明显增高 急性粒细胞白血病 M2 急性淋巴细胞白血病和急性早幼粒细胞白血病的原始及幼稚细胞多无吞噬能力 吞噬试验为阴性 急性粒 单核细胞白血病呈阳性反应 对鉴别有一定价值 慢性粒细胞白血病的成熟中性粒细胞吞噬能力明显减低 上一页 下一页 M5骨髓象的墨汁吞噬试验 返回 第一节 二 白细胞吞噬功能试验 原理 分离白细胞悬液 将待测的吞噬细胞与某种可被吞噬而又易于查见计数的颗粒物质如葡萄球菌混合 温育一定时间后 细菌可被中性粒细胞吞噬 可在镜下观察中性粒细胞吞噬细菌的情况 根据吞噬率和吞噬指数即可反映吞噬细胞的吞噬功能 下一页 第一节 参
3、考值 1 吞噬率 吞噬细菌的细胞数 200个 中性粒细胞 X100 正常人为628 114 2 吞噬指数 200各中性粒细胞吞噬细胞总数 200个 中性粒细胞 正常人为1 06 0 05 上一页 下一页 第一节 临床评价 吞噬细胞分大吞噬细胞和吞噬细胞两大类 前者包括组织中的巨噬细胞和血循环中的大单核细胞 后者主要是中性粒细胞 本试验可了解中性粒细胞的吞噬功能 如吞噬率和吞噬指数增高 反映中性粒细胞吞噬异物功能的增强 常见于细菌性感染 对疑有中性粒细胞吞噬功能低下者 有帮助确诊的价值 上一页 第一节 返回 三 血清溶菌酶活性试验 原理 溶菌酶能水解革兰氏阳性球菌的细胞壁乙酰氨基多糖成分 使细胞
4、失去细胞壁而破裂 以对溶菌酶较敏感的微球菌悬液为作用底物 根据微球菌的溶解程度来检测血清或尿中溶菌酶的活性 参考值 血清 5 15 mg L尿 0 2 mg L 比浊法 下一页 第一节 临床评价 l 血清溶菌酶含量增高可见于部分急性髓细胞白血病 急性单核细胞白血病 急性粒 单核细胞白血病 急性粒细胞白血病2 血清溶菌酶含量减低急性淋巴细胞白血病多数减低 少数正常 慢性粒细胞白血病血清溶菌酶含量正常 但急变时下降 上一页 第一节 返回 四 硝基四氮唑蓝还原试验 原理 硝基四氮唑蓝 NBT 是一种染料 其水溶性呈淡黄色 当被吞入或掺入中性白细胞后 有产生过氧化物酶的作用 可接受葡萄糖中间代谢产物葡
5、萄糖 6 磷酸在已糖磷酸旁路代谢中NADPH氧化脱下的氢 而被还原成非水溶性的蓝黑色甲颗粒 呈点状或片状沉着在胞浆内有酶活性的部位 可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分比 参考值 正常成人的阳性细胞数在10 以下 若有10 以上中性粒细胞能还原NBT 即为NBT还原试验阳性 低于10 则为阴性 下一页 第一节 临床评价 1 用于中性粒细胞吞噬杀菌功能异常的过筛鉴别和辅助诊断儿童慢性肉芽肿 葡萄糖 6 磷酸脱氢酶缺乏症 髓过氧化物酶缺乏症和Job综合征 NBT还原试验阳性 上一页 第一节 2 用于细菌感染的鉴别 3 器官移植后发热的鉴别 4 无丙种球蛋白血症 镰状细胞病 恶性营养不良等NBT还原阳
6、性细胞比例可降低 5 新生儿 小儿成骨不全症 心肌梗死急性期 淋巴肉瘤 NBT还原阳性细胞比例可增高 返回 五 白细胞趋化性试验 原理 在微孔滤膜的一侧放入粒细胞 另一侧放入趋化因子 细菌毒素 补体C3a 淋巴因子等 检测离体粒细胞潜过滤膜到达趋化因子这一侧定向移动的能力 参考值 趋化指数3 0 3 5 下一页 第一节 临床评价 趋化性是粒细胞到达炎症局部所必需的 本试验是观察粒细胞向感染灶运动能力的一项重要检测方法 趋化功能异常可见于Wiskot Aldrich综合征 幼年型牙周炎 糖尿病 烧伤 新生儿 慢性皮肤粘膜白色念珠菌病 高IgE综合征 先天性鱼鳞病 膜糖蛋白 相对分子质量11000
7、 缺陷症 肌动蛋白功能不全症 Chediak Hisashi综合征 上一页 第一节 下一页 Chediak Hisashi综合征 血象 骨髓象 返回 第一节 六 吞噬细胞吞噬功能试验 原理 活体巨噬细胞 单核细胞在体内外均有吞噬细菌 异物的功能 在体外将细胞与异体细胞或细菌混合孵育后 染色观测其吞噬异体细胞或细菌的数量 可了解其吞噬功能 利用中药斑螫在人的前臂皮肤上发疱 造成非感染性炎症 诱使单核细胞游出血管大量聚集于疱液内 抽取疱液则成为天然提纯的吞噬细胞悬液 以鸡红细胞为靶细胞 在体外370C条件下观察吞噬细胞对鸡红细胞的吞噬消化活性 取试管内的细胞进行涂片染色和镜检并计算吞噬百分率和吞噬
8、指数 下一页 第一节 参考值 吞噬百分率 62 77 1 38 吞噬指数1 058 0 049 临床评价 l 吞噬细胞吞噬功能低下主要见于各种恶性肿瘤 吞噬率常低于45 手术切除好转后可以上升 故可作为肿瘤病人化疗 放疗 免疫治疗疗效的参考指标 2 一些免疫功能低下的病人 吞噬率降低 可作为预测感染发生的概率 并观测疗效 判断预后的指标 上一页 返回 第一节 第二节白细胞代谢及其产物检验 一 末端脱氧核苷酰转移酶检测 一 酶标免疫细胞化学显示法 二 同位素检测法二 N 碱性磷酸酶检测三 酸性 醋酸酯酶检测 第二节 原理 末端脱氧核苷酰转移酶 TdT 是一种DNA聚合酶 它不需要模板的指导 就可
9、以催化细胞的脱氧核苷酸 使其转移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3 OH端 合成单链DNA 兔抗牛TdT抗体能和人细胞的TdT产生交叉反应 可采用免疫荧光技术或酶标免疫细胞化学技术 用辣根过氧化物酶 抗酶复合物在细胞涂片上定位 显示细胞内的TdT 结果 阳性反应为棕黄色颗粒 定位在细胞核上 TdT为早期T淋巴细胞的标志 在正常情况下不成熟的胸腺淋巴细胞出现阳性反应 正常人外周血细胞中极少或无活性 下一页 第二节 临床评价 95 以上急性淋巴细胞白血病和大约30 慢性粒细胞白血病急淋变患者外用血细胞有明显的TdT活力 病情缓解后阳性率逐渐减弱 在急性淋巴细胞白血病中 由于细胞表面标志不同 TdT活性也
10、有变化 T ALL 早B前体 ALL细胞的阳性率很高 B ALL细胞阴性 当外周血中此酶活性升高 就预示着血细胞的恶性变 因此TdT的测定对急性白血病的鉴别和治疗都有一定意义 返回 上一页 第二节 原理 以3H或14C标记的脱氧核苷三磷酸等的dXTP为基质 用低聚脱氧核苷 dA 等人工同聚物作为引物 由于酶反应与引物重合 使基质不溶于三氯醋酸 可用玻璃纤维盘将其吸附 从未被放射性核素标记的反应基质中分离出反应的生成物 计测放射活性 除去不加引物所测定的内源性反应所引起的活性之后 可测算酶的活性 参考值 正常人骨髓细胞的活性为dGTP掺入l 108个细胞的量为 0 0 09 mmol L 下一页
11、 第二节 临床评价 1 急性淋巴细胞白血病 B ALL除外 可检出较高的TdT活性 慢性粒细胞性白血病急性变时 约有1 3的病例在原始细胞中能检出高活性的TdT 2 恶性淋巴瘤中 原始淋巴细胞性淋巴瘤的淋巴结细胞中能检出高的TdT活性 3 此酶检查在研究造血细胞的分化与白血病的关系 白血病细胞的起源 白血病的治疗药物选择上都有较重要的价值 上一页 第二节 返回 原理 用P 硝基酚磷酸盐作为细胞碱性磷酸酶总活性检测的基质 在反应中生成P 硝基酚 测量400nm时的吸光密度 借以检测出细胞A Pase的总活性 此外 可通过CASP作为基质来测定N 碱性磷酸酶的活性 通过酶反应 生成半胱胺 这是用二
12、硝基苯置换5 硫 硝基酚酸 检测412nm的吸光密度 借以检测N APase的总活性 在基质液中加人用N 丁醇 水 1 3 的混合液提取粗酶液 室温下放置60分钟 记录酶反应 求出酶反应的速度 一般情况下 N APase的P NPP与CASP的水解速度之比 VP NPP VCASP 在1 1 2 0的范围内 平均为1 8 因此 N APase的活性可用VP NPP 1 8VCASP求出 再从VP NPP计算N APase的百分率 下一页 第二节 参考值 正常人的粒细胞 淋巴细胞中不能检出N APase的活性 临床评价 在AML及CML慢性期 CML急性变的原粒细胞中 均不能检出N APase
13、但在ALL和CML急淋变时 原始淋巴细胞能检出N APase 且不仅在非T ALL 非B ALL的幼稚细胞 就是在T ALL及具有B细胞标记物的原始细胞中亦可检出 因此 认为此酶是从未成熟的白血病性原始淋巴细胞向T细胞 B细胞分化过程中 未成熟的淋巴系统的细胞标志酶 此外 在鼻咽癌 喉癌等被认为是病毒感染的肿瘤细胞中 以及与EB病毒有关的传染性单核细胞增多症 Burkitt淋巴瘤等 均可检出此酶 上一页 第二节 下一页 T细胞白血病的血象 返回 原理 血细胞中的酸性 醋酸酯酶 ANAE 在弱酸性 pH5 8 条件下能将基质液中的 醋酸萘酯水解 产生 萘酚 产生的 萘酯酚再与六偶氮副品红偶联形成
14、不溶性暗红色偶氮副品红萘酚沉淀 定位于胞质内酶活性处 呈现单一的或散在的红色点块状或颗粒状 上一页 下一页 第二节 结果 酸性 醋酸酯酶 ANAE 主要分布在T细胞和单核细胞内 粒细胞 B细胞 红系细胞 巨核细胞和血小板中含量较少 T细胞为ANAE阳性细胞 胞质内有大小不等 数量不一的紫红色颗粒或斑块 B细胞为ANAE阴性细胞 胞质呈黄绿色 胞质内无红色斑块 单核细胞为ANAE阳性 其胞质内有细小红褐色颗粒斑块 上一页 下一页 第二节 酸性磷酸酶染色 上一页 下一页 临床评价 l 有助于区分T细胞和B细胞ANAE染色在T细胞胞质中呈现点状颗粒或大块局限阳性反应中细胞大多数为阴性反应 偶见稀疏弥
15、散细小颗粒 2 鉴别急性白血病类型急性T细胞白血病细胞为点状或块状阳性 局限分布 急性粒细胞白血病细胞ANAE染色大部分呈阴性或弱阳性反应 颗粒增多的早幼粒白血病细胞阳性反应较强 为弥散性分布 急单呈强阳性反应 胞质为均匀一致的弥散样淡红色或深红色 无点状颗粒 上一页 第二节 返回 第三节白细胞动力学检验 一 氚标记脱氧胸苷测定二 泼尼松刺激试验三 肾上腺素激发试验四 二异丙酯氟磷酸盐标记测定五 流式细胞仪检测DNA合成及含量六 粒细胞抗体检测 第三节 一 荧光免疫法检测 原理 受检血清中的抗体和粒细胞结合后 加标记荧光物质的羊抗人IgG血清 可使粒细胞膜显示荧光 然后在荧光显微镜下观察阳性比
16、率和荧光强度 结果 阳性反应表示受检血清中存在粒细胞抗体 临床评价 本法敏感性较好 特异性强 临床上常作为确诊免疫性粒细胞减少症的方法 下一页 第三节 二 化学发光法检测 原理 用化学发光技术测定单个核细胞与抗体被覆的粒细胞相互作用产生的代谢反应 间接测定抗粒细胞抗体 结果 用发光仪测定增强的化学发光反应 用发光指数表示结果 临床评价 本法比间接荧光免疫法更灵敏 可用于确诊免疫性粒细胞减少症 上一页 下一页 第三节 三 流式细胞技术检测 原理 采用正常人 O 型抗凝血分离出单核细胞和粒细胞 经1 多聚甲醛固定 二者再等量混合制成细胞悬液 加受检血清孵育 再加结合异硫氰酸荧光素 FITC 和抗人F ab 2IgG 采用流式细胞分析仪进行分析来检测同种反应性粒细胞抗体 结果 荧光强度与粒细胞抗体量呈线性关系 根据荧光强度的大小即可得出粒细胞抗体的量 临床评价 本法不但可对粒细胞抗体作半定量测定 还可以对抗体类型进行分析 以确定是否存在免疫复合物 上一页 返回 第三节 原理 分离的粒细胞并在培养过程中加入PHA或特异性抗原刺激后 进人有丝分裂期 此时加入3H TdR 可被细胞摄入参与DNA合
