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1、第四章载体的选择与构建 主要内容 1 细菌质粒载体2 噬菌体载体3 酵母细胞载体及大容量载体4 动 植物载体 1 1质粒的定义 质粒是染杂色体外能进行自主复制的遗传单位 由J 莱德伯格在1952年提出 共生生物 真核生物的细胞器DNA和细菌染色体以外的单纯的DNA分子某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体 酵母的杀伤质粒 killerplasmid 已知是RNA分子 1 质粒载体 1 2质粒的分类 1 2 1按照复制性质 严紧型质粒 带有与分配有关的基因 由DNA聚合酶 复制 当细胞染色体复制一次时 质粒也复制一次 1 2个 细胞 松弛型质粒 由DNA聚合酶 复制 当染
2、色体复制停止后仍然能继续复制 数十 数百个 细胞一般分子量较大的质粒属严紧型 分子量较小的质粒属松弛型 质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关 例如某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型 而在变形杆菌内则属松弛型 1 2 2按照构型 环形双链DNA分子共价闭合环状 两条链都保持完整的环状结构 通常呈超螺旋构型开环DNA 一条保持完整的环状结构 另一条单链上有一到几个切口线状DNA 这种质粒的双链断裂 由环状变为呈线状这三种构型的同一种质粒在琼脂糖凝胶中电泳时 出现不同的迁移速率 超螺旋构型最快 其次是线性构型 开环构型最慢 线性质粒 发卡线性质粒 在两端均有反向重复序列 形成共价闭合的发卡环多肽结合质
3、粒 5 端与多肽连接 同时两末端还具有反向重复序列 多为放线菌质粒这些结构可以防止质粒被降解 1 2 3按照接合能力 接合型质粒 F质粒 非接合型质粒 1 2 4按照宿主范围 广宿主质粒 以及穿梭质粒 单一宿主质粒 1 2 5按照宿主中的存在形式 游离型质粒整合型质粒 复制子不能被宿主识别 带有同源片段 1 2 6按照功能 基因克隆质粒 筛选系统 MCS 基因表达质粒 筛选系统 MCS 启动子 RBS 融合tag 基因敲除质粒 筛选系统 目的基因的同源片段 辅助性质粒 例如提供位点特异性重组酶 1 3质粒的复制 1 3 1复制子 replicon 包括复制起点 ori 复制控制元件 复制蛋白编
4、码基因的遗传单元质粒一般只带有少量复制需要的基因 其它由宿主提供 广宿主质粒一般携带复制所需的所有或大部分基因 而且启动子 RBS位点都可以被多种宿主识别 质粒中除了复制子之外的序列都不是必须序列 可以用其它序列替换来进行基因克隆或表达 pMB1 colE1replicon拷贝数15 20宿主范围小 肠细菌修饰的pMB1replicon拷贝数500 700宿主范围小 肠细菌 pUC系列 pSC101replicon拷贝数5宿主范围广多种革兰氏阴性菌pUB11050广多种革兰氏阳性菌pE1945广多种革兰氏阳性菌 1 3 2拷贝数控制机理 反义RNA对拷贝数的调控 colE1replicon R
5、NAII被RNaseH切割后充当复制引物链 前导链的引物 而RNAI与其结合后阻止RNaseH的切割质粒编码的Rop蛋白二聚体可提高两种RNA结合复合物的稳定性质粒拷贝数越高 Rop RNAI浓度越大 最终终止复制细胞分裂后 Rop及RNAI浓度变小 开始进行复制 RepA调控 Iteronsaredirectlyrepeatedsequences 17 22bp whichplayanimportantroleinregulationofplasmidcopynumberinbacterialcells 重复子 Ori附近的repA基因编码RepA蛋白 其对自身的表达具有负调节作用RepA蛋
6、白可以和Iterons结合 促进复制复合物的形成 从而开始质粒的复制质粒拷贝数高时 RepA蛋白浓度高 形成二聚体 两个质粒聚集连在一起 复制停止 细胞分裂后重新复制 pSC101replicon 1 4质粒的不稳定性 分离不稳定性 在细胞分裂过程中 有一个子细胞没有获得质粒DN 拷贝 并最终增殖成为无质粒的优势群体 结构不稳定性 由转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失 质粒的分配方式 主动分配平均分配 每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝配对位点分配 只有一对质粒呈主动分配 其余的是随机分配 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统 从而保证了质粒的高度稳定性随机分配分配不稳定 部
7、分子细胞没有质粒 并在生长过程中具有优势而逐渐使含质粒细胞比例越来越少 质粒上的par区段编码分配蛋白 质粒上还有par蛋白的结合序列 inc区 负超螺旋密度的增加可以使质粒分配更稳定 par区可以增加负超螺旋密度 DNA促旋酶则降低分配稳定性 partitionregion 质粒多聚体也导致分配不稳定 质粒多聚体含有多个复制起点 其复制速度是单体的数倍 将导致大量细胞只含有多聚体质粒而影响分配稳定性 有的质粒具有宿主致死功能 杀死丢失质粒的细胞 如F质粒的ccdA 编码解毒剂 ccdB 编码毒性蛋白 用同一复制系统的两种质粒会在复制和随后向子细胞的分配过程中彼此竟争 这样的质粒在同一个细胞中
8、不能和平共处 这种现象称之为不相容性 1 5质粒的不相容性 若两种质粒拷贝数不一样 分配有利于高拷贝数质粒 不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体 一般具有相同的复制子 1 型复制单向复制双向复制革兰氏阴性细菌中多数质粒是以 型方式复制 R1 R100等是单向复制 F R6k等是双向复制类型 1 6质粒的复制方式 在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制 如pC194 pE194等 这种方式会造成质粒结构的不稳定 存在大量的单链质粒DNA 2 滚环复制 质粒转移性 是指质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞 甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移 质粒在细菌间的转移 需要
9、供体和受体细胞间的直接接触才能进行 即接合作用 conjugation 这类质粒被称为自主转移质粒 self transmissibleplasmid 或接合质粒 conjugativeplasmid 有些质粒虽然不能自主转移 但能被其他一些自主转移质粒所转移 这类质粒又被叫做可移动质粒 mobilizableplasmid 可以借助这种方式将重组质粒导入难于转化的宿主中 1 7质粒的转移性 E coli质粒的转移性 G 菌中质粒分子量较大 而G 菌中质粒较小 已知大肠杆菌的F质粒 R1 R100 ColV Collb P9 R6k RP4等均属于自主转移质粒 它们是低拷贝的大质粒 其中较小的
10、R6k质粒也有38kb G 细菌如链霉菌中的自主转移质粒 除SCPl是巨大质粒外 很多都是10kb左右的小质粒 而与转移有关的区域只有2kb左右 自主转移质粒的大小差异可能是因为它们的转移机制不同 G 细菌中质粒的转移不需要性菌毛 因此质粒分子量较小 1 自主转移质粒的特点 大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点 它们在质粒自主转移过程中起着重要作用 自主转移质粒能诱导含有与自己相同或相似的oriT位点的非自主转移质粒进行转移 如将自主转移质粒整合到染色体上后 带动染色体转移也是从质粒的oriT位点开始的 tra基因 大多数tra基因的产物与性菌毛的形成 F RP4和pKMl01都编码
11、一根性菌毛 杂交对的形成有关 有些tra基因编码作用于oriT位点的内切酶 使质粒中的一条DNA链产生切口 从而开始转移 有些tra基因则与质粒转移调控等有关 oriT位点 oriT位点不仅是质粒转移的起始位点 也是质粒转移后DNA末端再环化的位点 因此质粒必须具有oriT位点才能进行自主转移 2 可移动质粒的特点 不能在菌株间形成接合通道 G 细菌中可移动质粒缺少与性菌毛合成有关的基因 约10个左右 因此 在进行转移时 必须利用位于同一细胞内的自主转移质粒编码合成的性菌毛才能进行 具有特殊的转移起始位点和切割功能基因 如ColEl具有独特的bom位点和负责DNA转移的mob基因 ColEl的
12、bom位点类似于F质粒的oriT mob基因的功能类似于tra基因 mob基因也能编码特异的核酸内切酶 在bom位点进行切割 但没有编码性菌毛的tra基因 所以它不能自主转移 F质粒诱动ColEl转移的模型图 1 8报告基因 抗生素抗性基因 kan cat bla spc em tet等组织化学显色基因 E colilacZ galactosidase 半乳糖苷酶 E coligusA uidA glucuronidase GUS 葡萄糖苷醛酸酶 荧光蛋白基因 rfp gfp 荧光素酶基因 luc荧光素酶在氧化底物荧光素 luciferin 的过程中 会发出生物荧光 可以通过荧光测定仪或液闪仪
13、测定荧光强度 可以极其灵敏 高效地检测基因的表达 是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法 报告基因 是为基因表达强度 蛋白定位等提供可测信号的一类基因 标记基因 为重组提供筛选标记的一类基因 蓝白斑筛选 互补筛选 原理 载体携带大肠杆菌 半乳糖苷酶基因 lacZ 的调控序列和前146个氨基酸 N端 称为 肽 的编码信息 宿主菌缺失lacZ基因的起始氨基酸 met 导致翻译在后续met处开始 其产物为 半乳糖苷酶的C端 称为 肽 肽段无催化能力 但可使 肽段正确折叠并形成稳定的四聚体 肽段单独无法正确折叠 因此两个肽段在一起才具有催化活性 这称为 互补 载体的 肽编码序列中
14、还插入一个不破坏阅读框的多克隆位点 MCS 由MCS编码的少数十几个氨基酸插入到 肽的氨基端不会影响其功能 然而 当外源DNA插入MCS后 几乎不可避免地导致其功能丧失 空载体进入宿主后在IPTG诱导下实现 互补 半乳糖苷酶分解X Gal产生蓝色物质 菌落为蓝色 连接有插入片段的载体在IPTG诱导下无 互补作用 X Gal不被分解 菌落为白色 X Gal 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 半乳糖苷IPTG 异丙基 D 硫代半乳糖苷 X Gluc 5 溴 4 氯 3 吲哚 D 葡萄糖苷 X gal Blue X gal Noinsert Insert 1 9质粒的提取 1 CsCl EtBr密度梯度
15、离心 Radloff 1967 溴化乙锭掺入DNA导致密度降低线性DNA和闭环DNA结合的溴化乙锭的量有差异 前者掺入的更多质粒纯度非常高 但耗时 仪器药品昂贵36万g 6h18万g 48h 温和裂解细胞 释放出质粒 而染色体 蛋白及细胞残余通过离心除去 2 碱裂解法 BirnboimandDoly 1979 线性DNA在pH12 12 6易变性 变性后不易复性而环状DNA不易变性 即使有部分发生变性也容易复性 溶液I 50mM葡萄糖 使菌体均匀悬浮 不易沉积结块 25mMTris Cl pH8 0 缓冲作用 10mMEDTA 螯合Mg2 等金属离子 失活DNase 25 24 1酚 氯仿 异
16、戊醇 变性蛋白质 溶液II 0 2NNaOH 裂解细胞 线性DNA变性 1 SDS 与蛋白质结合 溶液III 3M醋酸钾 置换SDS的钠离子 形成沉淀 并与基因组DNA共沉淀 2M醋酸 中和碱性pH 防止DNA断裂 无水乙醇 沉淀质粒DNA 碱裂解法流程图 对数期菌体 溶液III中和 溶液I充分重悬 溶液II裂解 上清液 抽提 离心洗涤 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 质粒DNA溶液 染色体DNA比质粒DNA分子大得多 且染色体DNA为线状分子 而质粒DNA为共价闭合环状分子 当加热处理DNA溶液时 40 50s 线状染色体DNA容易发生变性 共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀 而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中 从而可通过离心将两者分开 3 煮沸法原理 1 10质粒的改造 对天然质粒的改造 原则上仅需要保留其复制子的必需序列和标记基因 尽可能减少分子量 小质粒在提取纯化时不易破坏 可容纳更大的外源DNA 加入多克隆位点 MCS 便于在此处插入各种片段有1 2个可在宿主中表达的标记基因若改造成表达质粒 还需要加
