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1、实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法一、目的要求1. 学习微生物涂片、染色的基本技术,并掌握革兰氏染色的方法。2. 初步认识细菌的形态特征,掌握无菌操作技术。3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。二、基本原理1. 简单染色法:用单一染料进行细菌染色,操作简便,适于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色,这是因为:在中性、碱性或弱碱性溶液中,细菌细胞通常带负电荷,而碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时,其分子的染色部分带正电荷),因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色,经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下易于识别
2、。常用作简单染色的染料有:美蓝、结晶紫、碱性复红等。2. 革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是 1884 年由丹麦医生Gram 创立的。革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏染色阴性细菌,用 G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的,在染色过程中,当用乙醇处理时,由于脱水而引起网状结构中的孔径变小,通透性降低,使结晶紫碘复合物被保留在细胞
3、内而不易着色,因此,呈现蓝紫色;革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低,而脂类物质含量高,当用乙醇处理时,脂类物质溶解,细胞壁的通透性增加,使结晶紫碘复合物易被乙醇抽出而脱色,然后又被染上了复染液(番红)的颜色,因此呈现红色。革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂( decolorising agent)和复染液 (counterstain) 。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样,而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力,即以某种方式帮助
4、染料固定在细胞上,使不易脱落,不同类型的细胞脱色反应不同,有的能被脱色,有的则不能,脱色剂常用 95的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料,其颜色不同于初染液,复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色,而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色,从而将细胞区分成 G+和 G-两大类群,常用的复染液是番红。三、器材大肠杆菌(Escherichia coli),金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis),藤黄微球菌(Micrococcus luteus),蜡样芽孢杆菌( B. cereus)1220h 斜面培养物;革
5、兰氏染液,载玻片,显微镜等。四、操作步骤1. 涂片 取两块载玻片,各滴一小滴蒸馏水于玻片中央,用接种环以无菌操作分别从培养 1416h 的枯草芽孢杆菌和培养 24h 的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中,混匀并涂成薄膜。载玻片要洁净无油迹;滴蒸馏水和取菌不宜过多;涂片要均匀,不宜过厚。2. 干燥 室温自然干燥。3. 固定 固定时通过火焰 23 次即可。此过程称热固定,其目的是使细胞质凝固,以固定细胞形态,并使之牢固附着在载玻片上。热固定温度不易过高,以载玻片背面不烫手为宜,否则会改变甚至破坏细胞形态。4. 染色(1)简单染色法: 染色 滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美
6、蓝染色 12min;石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约 1min。 水洗 倾去染液,用自来水冲洗,直至涂片上流下的水无色为止。水洗时,不要直接冲洗液面,而应使水从载玻片的一段流下,水流不易过急过大,以免涂片薄膜脱落。 干燥 自然干燥或用电吹风吹干,也可用吸水纸吸干。 镜检 涂片干燥后镜检。(2)革兰氏染色法: 初染 加草酸铵结晶紫一滴,约 12min,水洗。 媒染 滴加碘液冲去残水,并覆盖约 1min,水洗。 脱色 将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用 95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止,约 2030s,立即用水冲净酒精。 复染 用番红液染 12min,水洗。 镜检 干燥后,置油镜下观察
7、。革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性。(3) 混合涂片法:按上述方法,在同一玻片上,以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应。实验二 细菌的芽孢和荚膜染色法一、实验目的1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。二、基本原理芽孢又叫内生孢子(endosopre),是某些细
8、菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体,通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理,用不同染料进行着色,使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低,着色、脱色均较困难,因此,当先用弱碱性染料,如孔雀绿(malachite green)或碱性品红(basic fuchsin)在加热条件下进行染色时,此染料不仅可进入菌体,而且也可进入芽孢,进入菌体的染料可经水洗脱色,而进入芽孢的染料则难以透出,若再用复染液(如番红液)或衬托溶液(如黑色素溶液)处理,则菌体和芽孢
9、易于区分。荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质,其主要成分是多糖类,不易染色,故常用衬托染色法,即将菌体和背景着色,而把不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄,易变形,因此,制片时一般不用热固定。三、器材枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),腊样芽孢杆菌(B. cereus),球形芽孢杆菌( B. sphaericus),生孢梭菌(Clostridium sporogenes);圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或胶质芽孢杆菌(B. mucilaginosus )约 2d 无氮培养基琼脂斜面培养物;孔雀绿染液,番红水溶液,苯酚品红溶液,黑色素溶液。荚膜
10、染色液:绘图墨水,1甲基紫水溶液,1结晶紫水溶液,6葡萄糖水溶液,20硫酸铜水溶液,纯甲醇等。四、操作步骤(一)荚膜染色技术方法一:(1)将培养 24h 左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌,作涂片、干燥、固定。(2)滴加 35 滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。(3)用木夹夹住载玻片在火焰上加热,使染液冒蒸汽但勿沸腾,切忌使染液蒸干,必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约 45min。这一步也可不加热,改用饱和的孔雀绿水溶液染 10min。(4)倾去染液,待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。(5)用番红水溶液复染 1min,水洗。(6)待干燥后,置油镜观察,芽孢呈绿色,菌体呈红色。
11、方法二:(1)取两支洁净的小试管,分别加入 0.2mL 无菌水,再往一管中加入 23接种环的腊样芽孢杆菌的菌苔,另一管中加入 23 接种环的生孢梭菌的菌苔,两管中各自充分混合成浓厚的菌悬液。(2)在 菌 悬 液 中 分 别 加 入 0.2mL 苯 酚 品 红 溶 液 , 充 分 混 合 后 , 于 沸 水 浴 中 加 热35min。(3)用接种环分别取上述混合液 23 环于两载玻片上,涂薄,风干后,将载玻片稍倾斜于烧杯上,用 95乙醇冲洗至无红色液流出。(4)再用自来水冲洗,滤纸吸干。(5)取 12 接种环黑色素溶液于涂片处,立即展开涂薄,自然风干后,油镜观察,在淡紫色背景的衬托下,菌体为白色
12、,菌体内的芽孢为红色。(二)荚膜染色技术1. 湿墨水法(1)制 备 菌 和 墨 水 混 合 液 加 一 滴 水 于 洁 净 的 载 玻 片 上 , 然 后 挑 取 少 量 菌 体 与其 混 合 均 匀 。(2)加盖玻片 将一洁净的盖玻片盖在混合液上,然后在盖玻片上放一张滤纸,轻轻按压以吸去多余的混合液。(3)镜检 用低倍镜和高倍镜观察,若用相差显微镜观察,效果更好。背景灰色,菌体较暗,在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。2. 干墨水法(1)在载玻片一端滴一滴 6葡萄糖水溶液,取少许培养了 72h 的圆褐固氮菌在水滴中制成菌悬液,充分混匀。(2)取一滴新配好的黑色素溶液(也可用绘图墨水)与菌悬液
13、混合,另取一块载玻片作为推片,将推片一端平整的边缘与菌悬液以 30角接触后,顺势将菌悬液推向前方,使其成匀薄的一层,风干。(3)用纯甲醇固定 1min。(4)加番红液数滴于涂片上,冲去残余的甲醇,并染 30s,以细水流适当冲洗,吸干后油镜检查,背景黑色,荚膜无色,细胞红色。3. Anthony 法(1)涂片 按常规取菌涂片。(2)固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。(3)染色 用 1结晶紫水溶液染色 2min。(4)脱色 以 20硫酸铜水溶液冲洗,用吸水纸吸干残液。(5)镜检 干后用油镜观察菌体染成深紫色,菌体周围的荚膜呈淡紫色。 实 验 三 鞭 毛 染 色 法 及 活 细 菌 运 动 性
14、 的 观 察一 、 目 的 要 求1. 学 习 并 初 步 掌 握 鞭 毛 染 色 法 , 观 察 细 菌 鞭 毛 的 形 态 特 征 。2. 学 习 用 压 滴 法 和 悬 滴 法 观 察 细 菌 的 运 动 性 。二 、 基 本 原 理鞭 毛 是 细 菌 的 运 动 “器 官 ”, 细 菌 是 否 具 有 鞭 毛 , 以 及 鞭 毛 着 生 的 位 置 和 数 目 是 细菌 的 一 项 这 要 形 态 特 征 。 细 菌 的 鞭 毛 很 纤 细 , 其 直 径 通 常 为0.01 0.02m, 所 以 , 除 了 很 少数 能 形 成 鞭 毛 束 (由 许 多 根 鞭 毛 构 成 )的 细
15、 菌 可 以 用 相 差 显 微 镜 直 接 观 察 到 鞭 毛 束 的 存 在 外 ,一 般 细 菌 的 鞭 毛 均 不 能 用 光 学 显 微 镜 直 接 观 察 到 , 而 只 能 用 电 子 显 微 镜 观 察 。 要 用 普通 光 学 显 微 镜 观 察 细 菌 的 鞭 毛 , 必 须 用 鞭 毛 染 色 法 。鞭 毛 染 色 的 基 本 原 理 , 是 在 染 色 前 先 用 媒 染 剂 处 理 , 使 它 沉 积 在 鞭 毛 上 , 使 鞭 毛直 径 加 粗 , 然 后 再 进 行 染 色 。 鞭 毛 染 色 方 法 很 多 , 本 实 验 介 绍 硝 酸 银 染 色 法 和 改
16、 良 的Leifson氏 染 色 法 , 前 一 种 方 法 更 容 易 掌 握 , 但 染 色 剂 配 制 后 保 存 期 较 短 。在 显 微 镜 下 观 察 细 菌 的 运 动 性 , 也 可 以 初 步 判 断 细 菌 是 否 有 鞭 毛 。 细 菌 运 动 性 的观 察 可 用 压 滴 法 和 悬 滴 法 。 观 察 时 , 要 适 当 减 弱 光 强 度 以 增 强 反 差 , 若 光 线 太 强 , 细菌 和 周 围 的 液 体 难 以 区 分 。三 、 器 材苏 云 金 芽 孢 杆 菌 (Bacillus thuringiengsis), 假 单 胞 菌 (Pseudomonas sp.), 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ;硝 酸 银 鞭 毛 染 色 液 , Leifson 氏 染 色 液 , 0.01 美 蓝 水 溶 液 ; 载 玻 片 , 盖 玻 片 , 凹 载 玻 片 ,无 菌 水 , 凡 士 林 , 显 微 镜