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1、http:/ 细胞污染的分析http:/ THP-1indent细胞:皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1 细胞是悬浮的。由于我们实验室养细胞的时间也不是很长,所以也只能说说自己平时的操作了。先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底,也就是细胞与细胞之间没有间隙时,就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液,用 D-Hanks液洗两遍,再 加入 0.25%的胰酶,加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底,然后静置两分钟左右,最好是能在显微镜下观察,当细胞之间出现间 隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶,加入含血清培养液,摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止
2、胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使细胞脱 落。再分瓶补加培养液。THP-1细胞的传代就比较简单了。可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好,没有其它杂质即细胞裂解物之类的,就 可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一,将余下的培养液分成两瓶,再分别补加培养液即可。 如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约 600转离心六分钟,细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂 质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵,那就提高转速可以 1000转离心六分钟,这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去
3、除上清液,加入新 的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。目前的方法就这些,希望对新手有所帮助/indentTHP-1 细胞是悬浮细胞,相对贴壁细胞要求高一点。细胞养不好,可能的原因有,THP-1 细胞特别依赖细胞浓度,ATCC 上 10 5到 106每 ML,是一个很高的密度,细胞少了就不太容易养好。1、细胞株的来源很重要,如直接来源于 ATCC(American Type Culture Collection 美国模式菌种保藏中心)生命力要强于国内细胞库的2、注意细胞的密度一定要高,介于 5105 106/ML之间,增值的快。细胞数量太少,不适合 THP-1生长,一般状态不好的 THP-1在培养了
4、 3天后数量仍然不多,继续培养一天或者两天,培养基 严重泛黄,细胞数量会巨增。这一点不同于同是单核细胞系的 U937细胞。3、THP-1 细胞适合在细胞 ph环境偏酸环境生长,对培养基变化非常敏感,所以 尽量使用相同 ph的 1640,4、还要注意,传代后切忌常移出培养箱观察,否则会影响细胞生长,状态变差,一般首先表现为细胞内颗粒变多。一般 THP-1 生长相当快,对于状态已经不好的情况,建议传代后 34 天再观察,一般 4天时间培养基已明显泛黄,细胞数量巨增。1)THP-1 细胞喜欢酸性条件,你不要 老是换培养基。越酸的条件,细胞密度越大,细胞就长得越好。2) 不要频繁换液,一般 2-3次换
5、液离心一次(只是补充培养基)3) 使用 1640(ATCC 推荐),注意加碳酸氢钠 2.5g就可以了,宁酸勿碱 4) 注意冻存的时候密度大些,推荐用血清冻存 5)感觉Hyclone的血清比较好 6)复苏比较慢,建议开始用小瓶,不要用一次性的聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 【试剂及配制】(1) 聚蔗糖- 泛影葡胺分层液:有成品供应,比重为 1.0770.0001。(2) 台盼蓝染液:称取 4g 台盼蓝,于研钵中用少量双蒸水研磨,加双蒸水至 100ml,1500r/min 离心15min,吸取上层液,即为 4%水溶液。用前,用 1.8%氯化钠溶液稀释 1 倍,即为 2%台
6、盼蓝染液。(3) HBSS 或 RPMI-1640 液【操作方法】(1 ) 采集静脉血若干 ml(随需要而定), 注入盛有肝素的无菌小瓶中 (每 1ml全血用 0.1ml 125250U/ml 肝素溶液抗凝), 加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝;(2 ) 用吸管加入等体积的室温 HBSS 或 PBS,使血液等倍稀释,可降低红细胞的凝聚, 提高分离效果(此步骤亦可省去);(3) 吸取淋巴细胞分层液(每 10ml 稀释血加 5ml 分层液) 置于 15ml 或 50ml 离心管中, 然后将离心管倾斜 45角,将稀释血液在距分层液界面上 1cm 处沿试管壁缓慢加至分层液上面 (亦可将吸管嘴插入离心管底
7、部,将分层液缓慢加在稀释血液的下面),应注意保持两者界面清晰, 勿使血液混入分层液内;(4) 将离心管置水平式离心机内,在 1820下,以2,000r/min 离心 20min。离心后 ,管内可分为以下四层: 上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板;下层为红细胞及粒细胞;中层为细胞分层液;分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。见图 1。 Ficoll-Hypaque 离心法分离血液成分 (5 ) 用毛细吸管轻轻插入灰白色层, 沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞, 盛入另一支离心管中;或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板, 再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞。既要尽量吸取所有单个核细
8、胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆, 以免混入其他细胞成分;(6) 将所得到的 PBMC 悬液用 5 倍体积的 HBSS 或 RPMI-1640 洗涤 2 次,依次以 2,000r/min、1500r/min 在室温下(18 25)离心 10min,可去掉大部分混杂的血小板;(7) 用完全 RPMI-1640 定容细胞,计数细胞后再调整细胞所需浓度。一般每 ml健康成人血可分离出 1106210 6个单个核细胞;(8) 用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性:取 2 滴细胞悬液加 1 滴 2台盼蓝染液,510min 后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色, 死细胞染成蓝色。计数 200 个细胞,计算活细
9、胞百分率, 一般活性应在 95以上。【注意事项】(1) 与血液样品接触时应注意生物安全防护, 避免血源性传染病。 (2) 操作应轻柔, 细胞悬液应充分混匀,避免损伤细胞活性及细胞丢失。 (3) 细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一,最适密度在室温下应为 1.0770.001g/L;应避光4下保存,取出后逐渐升至室温后混匀, 方可使用; 使用中应避免细菌污染。(4) 稀释血液可降低红细胞的凝聚,提高淋巴细胞收获量, 但如果要保留血浆成分作其它实验用时 ,则不能稀释血液 ,以免影响血浆成分。(5) 离心时的温度对分离效果亦有影响,温度过低,离心时间需适当延长,淋巴细胞丢失增多;温度过高, 增加
10、红细胞凝聚,且影响淋巴细胞活性. 离心时最适温度为 1820 。(6) 若从未抗凝血中分离单个核细胞,可先用链激酶溶解血凝块, 然后再按上述方法分离。(7) 分离组织中的单个核细胞亦可采用上述方法。高密度淋巴细胞分离液的配制及其应用市售淋巴细胞分离液密度为 1.0770.002 g/m1,适于人外周血淋巴细胞的分离。小鼠脾淋巴细胞的分离应使用密度为 1.088 g/m1的淋巴细胞分离液。国外已有该分离液出售,但目前国内尚无供应。我们用聚蔗糖(Ficoll 400)和泛影葡胺(Hypaque)将市售淋巴细胞分离液的密度调至 1.C89g/ml,用于小鼠脾淋巴细胞分离,取得了满意的效果。 材料和方
11、法 淋巴细胞分离液(P=l,哪 9 g/m1)的配制 量取 40Ficoll 400 溶液(上海试剂二厂)72 m1,泛影葡胺注射液(北京第三制药厂)25.3 ml,双蒸水 72.7 ml,混匀后加入密度1.077g/m1的淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)340 m1,再混匀。司 P20用比重天平测其密度;用冰点渗透压计测定渗透压两次,取平均值。抽滤除菌后分装,每瓶 6 ml,低温保存。 小鼠脾淋巴细胞的分离雄性 BALB/e小鼠,1620 周龄,体重 1418 g,摘除眼球放. 阅读(103) 评论 (0) 酸性 -醋酸萘酯酶染色法-转载一、原理 T 淋巴细胞质内含有酯酶,可以水解 -醋酸萘酯
12、,产生 -萘酚,-萘酚又可与重氮付品红偶联生成不溶性的偶氮付品红萘酚,在 T淋巴细胞浆酯酶存在的部位生成不溶性的黑红色的颗粒沉淀,而 B 淋巴细胞无此反应。以资鉴别。 二、材料与试剂 1固定液 40%甲醛 (可用 2.5%戊二醛代替)2分层液(聚蔗糖泛影葡胺) 比重 1.077+0.001,配制见细胞分离技术一章。 聚蔗糖泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名 Ficoll,分子量 400 000,多配制成 401%(W/V)水溶液,也有干粉出售. 应用时,用蒸馏水配制 9%溶液.泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名 Vrograf
13、in,结构式为 3,5二乙酰氨基 2,4,6 三碘苯甲酸 1去氧甲氨基山梨醇.含量为 60%或 75%,每安瓶为 20ml 装,常用于人的脏器造影.应用时, 取 60%泛影葡胺原液 20ml,加双蒸馏水 15.38ml,即为 33.9%泛影葡胺. 1.0770.001 聚蔗糖泛影葡胺的配制: 9%聚蔗糖液 24 份 33.9%泛影葡胺液 10 份混合即可.必要时, 可测比重.需要备用, 可用 G5 漏斗过滤除菌或 114.3高压灭菌 15min,4保存.一般可保存 3 个月. 如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算: 式中 dm 为分层液的比重,d1 和 d2 分别为 9%聚蔗糖和 33.
14、9%泛影葡胺的比重,V1 和 V2 分别为它们的体积.如需配制 1.077 比重的聚蔗糖泛影葡胺的分层液,则 9%的聚蔗糖和 33.9%的泛影葡胺的比例应为 10046.3. 3染色液 (1)副品红液:取 2g 副品红加入 2N HCl 100ml, 温水浴溶解后保存于 4备用。 (2)亚硝酸钠溶液(现用现配):取 0.14g 亚硝酸钠加入双蒸馏水 10 ml,振荡溶解。 (3)-醋酸萘酯溶液:取 2g-醋酸萘酯溶于乙二醇单甲醚(可用丙酮代替)100ml 中,贮于棕色瓶内,于 4保存。 (4)0.067 Mol/L pH7.6PB 液 甲液 KH2PO4 9.08 溶于 1 000ml 双蒸馏
15、水 乙液 KH2PO4 9.47g 溶于 1 000ml 双蒸馏水 (6)甲基绿复染液:取 1g 甲基绿,溶于 100ml 双馏水中,4 保存。 (7)应用染色液(孵育液)的配制 取 1ml 亚硝酸钠溶液缓慢滴入 1ml 的付品红液中,边加边摇匀,付品红液由红色变为浅黄色,混合后,静置 1min2min,将此混合液倒入 30ml pH7.6PB 液中,充分混合后,再加入 -醋酸萘酯溶液 0.85ml,边加边搅拌,混匀后使用。 三、操作方法 1标本的制备 取肝素抗凝血 1ml,加等量或适量的生理盐水稀释,取分层液 2ml 加入离心管内,然后将上述稀释的血液沿管壁缓缓加入至分层液上,注意不要打破两层界面。以水平转子离心机 1 0001 500r/min 离心 20min。结果形成四层,最上面第一层为血浆层,第二层为淋巴细胞(包括单核细胞)层,第三层为分层液,第四层为红血球。用毛细管吸取血浆层,然后吸取淋巴细胞放入适量的 Hanks 液(或生理盐水)中,充分摇匀。2 000r/min 离心 5min10min 弃上清液,再重复洗涤一次,即获淋巴细胞。以此淋巴细胞粥涂片。自然干燥后,以 40%甲醛蒸汽固定 10min。 2染色镜检 (1)于固定的标本