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1、细胞增值调控与肿瘤的分子基础 刘新文 北京大学医学部生化与分子生物学系 TheRegulationofCellGrowthandTheMolecularBasisforTumorigenesis 第一节细胞周期概述 细胞周期 cellcycle 又称 细胞分裂周期 是指一个细胞经生长 分裂形成两个细胞所经历的全过程 即细胞从一次分裂结束到下一次分裂结束所经历的全过程 1 G1期 gap1phase 2 S期 synthesisphase 3 G2期 gap2phase 4 M期 mitosisphase 5 G0期 Interphase Long G1 CellgrowthS DNArepli
2、cationG2 Cellgrowth M phase mitosis Short ChromosomesegregationCytokinesis LelandH Hartwell R Timothy Tim Hunt SirPaulM Nurse 2001年10月8日美国人LelandHartwell 英国人PaulNurse TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖 第二节细胞周期调控的关键分子 细胞周期调控的核心蛋白 2 细胞周期蛋白 Cyclin Cdk的正调节因子 1 周期蛋白依赖性蛋白激酶 Cyclin dependentkinases Cdks 细胞
3、周期调节的中心环节 3 Cdk抑制蛋白 Cyclin dependentkinaseinhibitors CKIs Cdk的负调节因子 一 细胞周期蛋白 Cyclins 细胞周期蛋白 Cyclins 是一类伴随细胞周期的不同阶段表达 累积和降解的蛋白质因子 细胞周期蛋白盒 Cyclinbox 与Cdk结合 激活Cdk的蛋白激酶活性毁灭盒 Destructionbox 在Cyclin的自身降解中发挥重要作用 1 结构特点 2 调控机理 Cyclin与Cdk形成二聚复合体 催化亚基为Cdk 调节亚基为Cyclin DestructionBoxinCyclins 不同类型的CDK cyclin复合体
4、 CyclinD包括D1 3 各亚型cyclinD在不同细胞中的表达量不同 但具有相同的功效 3 分类 A H 细胞周期中不同类型cyclin的表达变化 二 周期蛋白依赖性蛋白激酶 周期蛋白依赖性蛋白激酶 Cdks 是一类Ser Thr蛋白激酶 在细胞周期的调节中起关键作用 人体细胞内主要有Cdk1 Cdc2 Cdk2 6 Cdk7 CAK和Cdk8等 活性中心 ATP结合部位 催化部位调节亚基Cyclin的结合部位 正调节P13suc1的结合部位 负调节 阻止细胞进 退M期 1 结构特点 3个主要功能域 2 没有酶量的调节 在整个细胞周期中 某一Cdk的含量恒定 其活化Cdk与非活化Cdk的
5、总量不变 CdK的结构 抑制性磷酸化位点 cyclin结合位点 ATP结合位点 b 催化部位 ATP结合位点 T loop 活性磷酸化位点 自身磷酸化位点 CyclinA Cdk2 CDKactivating 3 组成 结构调节 活化与非活化Cdk的比例 正性调节 人Cdk与特定的Cyclin结合才有活性 也只有Cyclin降解才能使Cdk最终失活 负性调节 CKI与Cdk结合后阻止Cdk磷酸化 共价调节 抑制性位点磷酸化失活 Wee1激酶 去磷酸化复活 Cdc25磷酸酶 协调调节 人Cdc2的Thr160 161和Thr14 Tyr15磷酸化 可促进Cdk Cyclin结合 这种磷酸化又依赖
6、Cyclin Cyclin与Cdk的结合可导致CdkT环的移开 暴露出其中的Thr160 161位点 MPFactivitycontrolledby 1 cyclinBlevels2 phosphorylationofcdk1 Multiplelevelsofregulationprovideinputfor checkpointcontrol M phasepromotingfactor MPF cdk1 cyclinB CDK激酶 CDKactivatingkinase CAK 磷酸化Thr161Wee1激酶 磷酸化Tyr15 Thr14 依赖Cyclin的蛋白激酶 Cdc Cdk 三 C
7、dk抑制蛋白 CKIs Cdk抑制蛋白是Cdk的负调节因子 拮抗Cyclin的作用 阻止细胞经过检验点 1 CIP KIP Kinaseinhibitionprotein 家族 广泛抑制Cdk1 Cdk2 Cdk4 6 Cyclin复合物 因其N端和C端分别具有不同的结构和功能 故又称双重特异家族 包括p21 p27和p57 1 CKI两大家族 2 INK4 Inhibitorofcdk4 家族 特异性抑制Cdk4 6 DCyclins 因其结构中含有数个具强烈疏水性的锚蛋白 ankyrin 重复序列 故又称锚蛋白家族 包括p15 p16 p18和p19 p21 p21是第一个被发现的CKI基
8、因 1993年 其抑制作用最广泛 对细胞周期各期的Cdks均有明显的抑制作用 由于其表达蛋白质分子量为21kD 而且最初认为它与野生型p53的生物活性有关 故命名为p21WAF 1 Wild typep53ActivatedFragment 1 后又发现p21与细胞老化等多种因素有关 故又称p21SDL1 Cip 1 CAP20 PIC1等 第一个被发现的CKI基因p21定位于6p21抑制作用最广泛表达蛋白质分子量为21kD p21的功能 可能作用于细胞周期的多个环节 P21可与Cyclin Cdk和增殖细胞核抗原 PCNA 组成四聚体 其N端结构域与Cyclin Cdk结合 抑制Cyclin
9、 Cdk磷酸化Rb蛋白 阻止细胞进入S期 当细胞在S期发生DNA损伤时 p21的C末端结构域与PCNA直接结合 抑制DNA聚合酶 活性 阻止损伤DNA长链的复制 但p21不能抑制DNA复制起始复合物的形成和DNA缺口的修补 所以 DNA的修复不会被抑制 p21基因的启动子区域含有p53蛋白的结合位点 p16 p16又称MTS1基因 Multipletumorsuppressor1 其编码蛋白质的分子量约为16kD 主要抑制Cdk4的活性 故命名为p16INK4A p16基因定位于9p21 22其编码序列由3个外显子组成有 两个转录本 表达蛋白质分子量为16kDN端含有一个与细胞周期蛋白盒N端同
10、源的序列 还含有4个锚蛋白重复序列 可抑制Cdk4或Cdk6的活性 使其不能对Rb磷酸化 Cyclins Cdks CKIs的相互作用关系 p21andp27inhibitassemblyandactivityofcdk4 6 cyclinDandcdk2 cyclinEbyCAK TheyalsoinhibitcycleprogressionindependentofRBactivity p16inhibitsbothassemblyandactivityofcdk4 6 cyclinD 一 细胞周期的驱动 1 G1期 在生长因子诱导下 CyclinD首先被合成 于G1中期达到峰值 并与Cd
11、k4 Cdk6结合形成CyclinD Cdk4或CyclinD Cdk6复合物 又称G1 CdkC 激活Cdk4或Cdk6的蛋白激酶活性 使Rb蛋白磷酸化 磷酸化的Rb蛋白与结合的E2F 无活性 分离 释放出有活性的E2F E2F作为转录因子激活与DNA复制相关基因的表达 使细胞进入S期 第三节细胞周期的调节 positivefeedbackloop RbphosphorylationmaintaineduntilCyclinBdestruction 细胞周期的驱动 2 S期 CyclinD降解 CyclinE和A积累 先后与Cdk2结合为CyclinE Cdk2复合物 又称G1 S CdkC
12、 及CyclinA Cdk2复合物 又称S CdkC 维持DNA复制 3 G2期 CyclinE降解 CyclinB积累 并与Cdc2 Cdk1 结合 形成促成熟因子 maturation promotingfactor MPF 复合体 即M CdkC 细胞中的蛋白激酶将Cdc2的Tyr15和Thr14磷酸化 形成无活性的前MPF pre MPF 未磷酸化的活性MPF能激活磷酸酶Cdc25 将Cdc2的Tyr15和Thr14去磷酸化 从而激活更多的MPF Cdc2的自催化过程 促使染色体浓缩 微管蛋白磷酸化 细胞骨架的重新组合 推动细胞分裂 4 M期 CyclinB和泛素 ubiquitin
13、被磷酸化 在特定酶的作用下 磷酸化的CyclinB泛素化 然后由依赖泛素的蛋白水解酶催化降解 结果使Cdc2失去调节单位而失活 细胞回到G1期 促后期复合物 APC 对M Cyclin及分裂期其他调控因子的泛素化和蛋白水解起重要作用 Proteindegradationisimportantinmitosis 细胞周期驱动的核心成分是Cdks Cyclin Cdk复合物活性的调控决定着细胞周期的进程 二 Cyclin Cdk复合物的调节 结构调节 Cdk亚基的磷酸化 CKIs的结合 数量调节 Cdk调控因子的转录调控 Cyclins的水解 主要机制 泛素依赖的蛋白质水解限速步骤 泛素连接酶催化
14、的泛素转移反应 关键酶 SCF Skp1 Cdc53 cullin F boxproteincomplex 和APC Anaphase promotingcomplex 促后期复合物 泛素化并降解细胞周期调控蛋白 TheRegulationofAPCinCellCycle 第三节细胞周期的调节 基因调节 Cdk的时相性激活是细胞周期调控机制的核心 其主要依赖于Cyclin的细胞周期特异性或时相性表达 累积和降解 生长因子及其受体调节抑素调节 细胞自身产生的终止增殖的信号分子cAMP和cGMP调节 含量随细胞周期呈周期性变化激素调节 生长激素 雌激素等可刺激细胞生长Ca2 和钙调素调节 高Ca2
15、 水平直接或间接激活蛋白激酶从而调节细胞增殖活动 G1期的启动是细胞周期的关键 G1 S限制点 生长因子 Growthfactor G1 S G2 M 抑素 Chalone G1 S G2 M 三 细胞周期检测点与细胞周期监控 细胞周期检测点 checkpoint 保证细胞周期中DNA复制和染色体分配的检测机制 细胞一旦通过了检测点 就可以完成细胞周期 这是一类负反馈调节机制 细胞周期监控 当细胞周期进程中出现异常事件 如DNA损伤或DNA复制受阻时 检测点调节机制被激活 及时地中断细胞周期的运行 待细胞修复或排除故障后 细胞周期才能恢复运转 CheckpointsinEukaryoticCe
16、llCycle 细胞周期检测点分类 1 细胞周期检测点分类 1 DNA损伤检测点 DNAdamagecheckpoint 负责检测DNA有无损伤 合成有无错误 G1晚期检测点 G1 S转换点 关键性检测点 控制从G1期进入S期 决定细胞是进入细胞周期 或暂时滞留在G1期 或退出周期 在哺乳类动物细胞中 G1检测点称为R点或限制点 restrictionpoint 酵母中为启动点 start G2期检测点 G2 M转换点 保证细胞DNA复制的完整 2 DNA复制检测点 DNAreplicationcheckpoint 负责DNA复制的进度 3 纺锤体组装检测点 spindleassemblycheckpoint 或中期检测点 metaphasecheckpoint 管理染色体的分配 细胞周期检验点 2 细胞周期监控分子 Rb蛋白处于细胞生长和分化调控的中心环节 对细胞周期两个关键的调控点 G1 S和G2 M行使 闸门 作用 Rb蛋白的活性决定细胞周期进程 G1早期和G2期 Rb蛋白处于非磷酸化或低磷酸化状态 与转录因子E2F结合 抑制cyclinE cyclinA等基因转录 G1中期 S
