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1、大型真菌分子遗传连锁图谱研究进展刘伟 肖扬 边银丙*华中农业大学应用真菌研究所 武汉 430070A review of research advance of molecular genetic linkage map in macrofungiLIU Wei XIAO Yang BIAN Yin-Bing*The Institute of Applied Mycology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China大型真菌（macrofungi）中包括一些重要的食用真菌和药用真菌，在人类的经济生活中占有十分重要的地位（Cha
2、ng & Miles 1989）。真菌学研究是生物学研究中的一个重要分支，但对大型真菌遗传学的系统研究目前仍集中在少数分类单元中，例如子囊菌中的链孢属Alternaria、Neurospora及担子菌中的鬼伞属Coprinopsis和裂褶菌属Schizophyllum（Peever et al. 1999；Nargang & Rapaport 2007；Kes 2000；Clark & Anderson 2004）。近年来，随着现代生物学研究技术和方法的飞速发展，真菌分子生物学研究也不断深入，在系统发育、遗传作图、基因定位、基因克隆及遗传转化等方面都有了长足的发展（Hamer & Givan
3、1990；Zhong et al. 2002；Fincham 1989）。分子遗传连锁图谱（genetic linkage map）是基因组内反映基因以及专一性多态性DNA标记相对位置的图谱，能显示标记和基因在染色体上的相对位置，有利于更好地理解基因组结构和进化，是进行基因组系统研究的基础，也是遗传学研究的重要方向（Botstein et al. 1980；Marra et al. 2004；de Vos et al. 2007；Manzo-Snchez et al. 2008；Xu et al. 2009）。遗传连锁图谱的构建以及建立在此基础上的数量性状（quantitative trait
4、 loci）定位成为了现代遗传学研究中的热点（Lander & Botstein 1989；Liu et al. 2004；Fischer et al. 2004；Welter et al. 2007）。1 大型真菌分子遗传图谱研究的现状真菌遗传图谱的构建工作较高等动植物起步晚，研究基础相对落后，其构建方法主要参考高等动植物。构建过程包括：1）确定作图群体及亲本的组合；2）培养大量遗传标记处于分离状态的分离群；3）确定作图群体中不同个体基因型；4）选择合适的分子遗传标记；5）构建标记间的遗传连锁群。大型真菌分子遗传图谱的构建工作最早始于Kerrigan et al.（1993）对双孢蘑菇Aga
5、ricus bisporus的遗传研究。随后糙皮侧耳Pleurotus ostreatus（Larraya et al. 2000）、香菇Lentinula edodes（Terashima et al. 2002；Kwan & Xu 2002；Terashima et al. 2006； et al. 2008）、灰盖鬼伞Coprinus cinereus（Muraguchi et al. 2003）、双色蜡蘑Laccaria bicolor（Labb et al. 2008）、肺形侧耳Pleurotus pulmonarius（Yasuhito et al. 2009）和Amyloster
6、eum areolatum（van der Nest et al. 2009）等图谱的构建工作也相继展开。据统计，目前公开发表的大型真菌遗传连锁图谱仅有14张（表1），而国内还未见有相关的研究报道。双孢蘑菇和香菇是两种重要的食用菌，也是大型真菌遗传学研究中研究比较深入的食用菌。表1 大型真菌遗传连锁图谱构建情况Table 1 Construction of macro-fungi genetic linkage map物种Species构图群体Population遗传标记Genetic marker连锁图谱Genetic linkage map参考文献Reference标记数Number覆盖长
7、度Length (cM)连锁群数Linkage number平均图距Average distance (cM)双孢蘑菇Agaricus bisporus52RAPD、RFLP64543.811/Kerrigan et al. 1993103SCAR、Others7281/Callac et al. 1997121RAPD、SCAR26339.55/Moquet et al. 1999118AFLP、SSR、CAPS、Others3201156133.9Marie et al. 2010双色蜡蘑Laccaria bicolor45AFLP、RAPD、SSR、SNP294812132.76Labb
8、 et al. 2008糙皮侧耳Pleurotus ostreatus80RAPD、RFLP2031000.7115.3Larraya et al. 200080RFLP、Others99106111/Park et al. 2006肺形侧耳Pleurotus pulmonarius150AFLP300971125.2Yasuhito et al. 2009灰盖鬼伞Coprinus cinereus40RAPD、RFLP247134613/Muraguchi et al. 2003香菇Lentinula edodes95AFLP2031956.7119.5Terashima et al. 20
9、0232RAPD、SSCP69622.4149.0Kwan & Xu 200295AFLP-H1661398.4118.4Terashima et al. 200692RAPD、SSCP、SCAR289908.8113.1et al. 2008Amylostereum areolatum80AFLP2041693258.3van der Nest et al. 20091.1 双孢蘑菇遗传连锁图谱的构建双孢蘑菇在西方国家己有300多年的栽培历史，而且对它的研究也较为深入。双孢蘑菇的担孢子多数为异核体，仅有少量的同核体，获得用于分析子代重组率的单倍性同核体较为困难（Elliott 1985；Mo
10、quet et al. 1998）。Kerrigan et al.（1993）在1993年构建了双孢蘑菇的第一张遗传图谱，作图群体由52个个体组成，其中包含从671个单孢分离物中获得的48个同核体，1个异核体单孢（n+n）以及通过这个异核体单孢原生质体再生获得的3个同核体（n）。利用包括同工酶标记、RAPD标记、RFLP、rDNA标记以及少量表型性状在内64个标记，得到11个连锁群，其中9个连锁群通过核型电泳和点杂交可以与对应的染色体相吻合。该图总长度有543.8cM，与染色体物理距离之比大约为48.5kb/cM，覆盖了基因组的大部分。Callac et al.（1997）利用来自JB3-83
11、U1-7杂交的后代103个同核体作为群体，构建了染色体I的连锁图。该图跨度28cM，有4个源自RFLP的SCAR标记和一个异型酶羧肽酶位点PEP2，一个交配型座位MAT以及担孢子数量位点BSN。染色体I的遗传图谱是对Kerrigan et al.（1993）在1993年所构建的双孢蘑菇遗传图谱的进一步丰富和补充，也表明了由不同作图群体构建的遗传图谱可以在遗传标记的定位上找到切入点，进行对比研究和使用。Moquet et al.（1999）将JB3-83U1-7的子代同核体群体数量扩大到121个，通过SCAR、RAPD和同工酶乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）标记分
12、析，将26个标记定位在5个连锁群上。与Callac et al.（1997）构建的图谱比较发现，在相同的连锁群上（连锁群I）相同标记间的距离增大，标记间的顺序有变。研究表明群体数量的选择至关重要，它会影响到标记之间的准确定位。Marie et al.（2010）用双孢蘑菇异宗结合突变株A. bisporus var. burnettii和次级结合变异株A. bisporus var. bisporus的种内杂交获得的118个同核体，用31个AFLP、21个SSR、68个CAPS和MAT、BSN、PPC1、ADH基因标记，构建了一张覆盖度为1,156cM、平均图距为3.9cM，共13个连锁群的连
13、锁图谱，与染色体物理距离之比大约为33.05kb/cM，这也是双孢蘑菇第一张详尽的分子遗传连锁图谱。双孢蘑菇总遗传图谱长度（Le）估计在1,256cM，据此估计，在这张连锁图中，以20cM的距离间隔存在一个标记的话，此图能覆盖双孢蘑菇99%的基因，以10cM一个标记为间隔，将能覆盖双孢蘑菇93%的基因。1.2 香菇遗传连锁图谱的构建香菇是年产量仅次于双孢蘑菇的世界第二大食用菌（Lin et al. 2000），属于四极性异宗结合担子菌，其交配系统由2个非连锁的交配型因子A与B控制（Tokimoto et al. 1973；Murakami & Takemaru 1975）。早期的香菇遗传图谱是
14、用形态标记和生化标记所构建的（Hasebe 1991；Bowden & Royse 1991）。2002年，Kwan & Xu（2002）最早构建了香菇的分子遗传连锁图，亲本菌株L-54采用原生质体单核化处理后获得两种不同交配型（A1B1、A2B2）的单核体，作图群体为32个F1（L-54 A1B1A2B2）的孢子单核体，共采用62个RAPD标记，3个基于BSA（bulked-segregant analysis）的RAPD标记，2个表型位点（Mat-A、Mat-B），1个基因（priA）位点和1个测序的DNA片段位点（MAT）构建了14个连锁群，该图谱的总长度为622.4cM，平均图距9.0
15、cM。Terashima et al.（2002）2002年构建了香菇的AFLP连锁图。作图群体为亲缘关系较远的2个菌株杂交后所得的95个单孢子后代，该图有203个AFLP标记和2个交配型因子，共鉴定了11个连锁群，其中有8个大连锁群和3个小连锁群，遗传图谱总长度为1,956.7cM，平均约18.4kb/cM。Terashima et al.（2006）之后通过高效基因组扫描（high-efficiency genome scanning）电泳系统得到的AFLP标记（AFLP-H）及一些功能位点的整合，进一步完善了于2002年构建的连锁图，该图仍为11个连锁群。该图谱包含10个功能性基因位点，这对于香菇遗传连锁图谱之间的对比分析较为有利，如该图中MatA和PriA都定位在连锁群LG上，表明此连锁群与Kwan构建的连锁图中LG 相对应（Kwan & Xu 2002）。2008年，Miyazaki et al.（2008）选取了23个香菇四分体孢子组合共计92个孢子单核体为作图群体，构建了一张包括28
