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1、第十五章遗传性疾病的分子诊断 基因工程研究所南方医科大学 教学目的与要求 了解遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前 包括胚胎植入前 遗传缺陷分子诊断的适应症 熟悉遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化 掌握遗传性疾病及产前 包括胚胎植入前 遗传缺陷的经典检测方法及临床意义 重点遗传性疾病及产前 包括胚胎植入前 遗传缺陷的经典检测方法及临床意义 难点遗传性疾病的分子机制 本章目录 第一节遗传性疾病分子诊断的策略 第二节遗传病的分子诊断第三节产前 包括胚胎植入前 遗传缺陷的分子诊断 第一节遗传性疾病分子诊断的策略 一 直接诊断策略二 基因多态性连锁分析三 基因突变的定量 dosage 诊断 一 直
2、接诊断策略 定义 直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变 类型 点突变缺失插入倍增 前提 基因已经克隆 序列和结构清楚 一 点突变的诊断 1 基因背景清楚的点突变等位基因特异性寡核苷酸杂交 allelespecificoligonucleotide ASO PCR ELISA等位基因特异性扩增 allelespecificamplification ASAPCR RFLP测序基因芯片技术等进行诊断 2 基因背景未知的点突变 单链构象多态性 single strandconformationalpolymorphism SSCP 变性梯度凝胶电泳 denaturinggradientgelelec
3、trophoresis DGGE 异源双链分析 heteroduplexanalysis HA DNA序列测定蛋白截短测试 proteintruncationtest PTT 二 片段性突变的检测 1 少数核苷酸缺失或插入检测点突变的方法 2 大的片段突变Southern印迹技术 多重PCR技术 片段性突变是指DNA分子较大范围发生突变 碱基的缺失 插入 扩增和重组 二 基因多态性连锁分析 检测原理 多态性连锁分析 关联分析 检测前提 致病基因尚未被定位和阐明 基因太大 突变种类太多 检测方法 RFLP VNTR STR SNP 三 基因突变的定量诊断 检测方法 细胞分裂中期染色体检测固相杂交
4、PCR扩增 检测内容 大范围的重复 缺失 第二节遗传病的分子诊断 一 血红蛋白病二 血友病三 肌营养不良症四 苯丙酮尿症五 囊性纤维化六 亨廷顿病七 脆性X综合征 一 血红蛋白病 血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构 每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧 Hb亚基之间通过8对盐键 使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白 珠蛋白基因簇 16p13 33 p13 11 11 15 5 珠蛋白基因簇 血红蛋白的类型 成人Hb HbA 2 297 98 HbA2 2 22 3 胎儿Hb HbF 2 2 2G 2 2A 2胚胎Hb HbGower 2 2 2G 2 2A 2 妊娠12周内 HbGower
5、 2 2HbPortland 2 2 血红蛋白类型 血红蛋白病hemoglobinopathy结构异常血红蛋白病镰刀状细胞贫血 不稳定血红蛋白病血红蛋白M病氧亲和力改变地中海贫血 珠蛋白的合成降低或消失 1 镰刀形红细胞贫血 正常细胞 镰刀状贫血病 血液中大量出现镰刀红细胞 其携带氧的功能只有正常红细胞的一半 患者常因此缺氧窒息 N val his leu thr pro glu glu C 146 HbS 肽链 HbA 肽链 N val his leu thr pro val glu C 146 镰刀状细胞贫血分子机制 GTGCATCTGACTCCTGAGGAG GTGCATCTGACTCC
6、TGTGGAG 分子诊断方法 限制性内切酶法 RE ASOARMS 跨越断裂点的PCR 裂口PCR gap PCR S 肽链 A 肽链 ACTCCTGAGGAG ACTCCTGTGGAG RE法 SouthernBlot MstIICCTNAGG GGANTCC 1 15kb 0 2kb 1 35kb AS S S 肽链 A 肽链 ACTCCTGAGGAG ACTCCTGTGGAG RE法 PCR RFLP DdeICTNAG GANTC 268bp AS S A 175bp 175 268 443 思考题 作业 书中239页中关于HbE检测请回答下列问题 1 HbE的突变碱基改变情况 2 该
7、突变位于蛋白质的第几个氨基酸 3 突变位点位于氨基酸哪一个外显子上 4 写出基因组参考序列中此外显子后的内含子序列 5 和3 端各5个碱基 5 用MnlI酶切后 请列出各种可能的情况 6 结合所学习的知识 请再写出几种可能用于诊断的方法 2 地中海贫血 由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性 溶血性疾病 类型 地中海贫血 地中海贫血 地中海贫血 地中海贫血 以此类推 地中海贫血 地中海贫血 每条16号染色体上有两个 Gene 缺失程度不同 链合成部分或完全受到抑制 导致不同类型的地贫 若一条染色体上缺失一个 基因 为 地贫 链合成减少 若一条染色体上两个 基因均缺失 为 0地贫
8、 链不能合成 胎儿水肿 地贫的分子基础 依 基因缺陷程度分为 Gene缺失型 缺失1 个 基因 非Gene缺失型 点突变 无义突变 移码突变 终止密码突变 剪接突变等结果1生成无功能或稳定性降低的mRNA无义突变移码突变终止密码突变起始密码突变2RNA加工突变3产生不稳定Hb 地中海贫血的分子机制 分子诊断方法 1 PCR法PCR法已经成为鉴别缺失型 地中海贫血的首选方法 2 ARMS法该法能快速鉴别诊断HbCS和HbQS 3 ASA法与ARMS法相类似 4 SSCP法非缺失型 2地中海贫血突变 5 等位基因特异性扩增技术 ASPCR 法 地中海贫血 珠蛋白Gene突变或缺失 珠蛋白链合成速率
9、下降 溶血性贫血 0地贫 链完全不能合成 地贫 链可部分合成 地中海贫血临床分类 患儿颅骨及面颊部骨骼增大 头颅变大 额部隆起 颧高 鼻梁塌陷 两眼距离增宽 眼睑浮肿 形成地中海贫血的特殊面容 X线颅骨照片可见颅骨内外板变薄 板障增宽 在骨皮质间出现垂直短发样骨刺 地中海贫血的分子基础 地中海贫血已发现100多种突变类型 包括点突变和基因缺失 绝大多数 地中海贫血是由于 基因发生点突变所致 突变涉及基因内及侧翼序列 1 编码区突变 2 非编码区突变 3 启动子区突变 4 RNA裂解信号突变 5 加帽位点单个碱基突变 编码区突变 mRNA稳定性降低或形成无功能mRNA 1 无义突变密码子17 A
10、 C密码子43 G T 0地贫 2 移码突变密码子71 72 A密码子41 42 TCTT 0地贫 3 起始密码突变ATG AGG 0地贫 内含子IGT AT丧失一个剪切信号 新的切点产生同义突变 激活 I和Exon隐蔽裂解位点如 GGT AGT产生新的剪切点 非编码区突变 影响mRNA剪切 加工过程 GT AT GGT AGT 激活隐蔽剪切位点 启动子区突变 降低mRNA的转录效率 28位A G突变破坏了TATABox RNA裂解信号突变 不能准确裂解和加polyA 珠蛋白基因3 侧翼序列中AATAAA AACAAA 加帽位点单个碱基突变 不能准确裂解和加polyA 加帽位点发生A C颠换
11、影响转录效率 通常是mRNA的第一个核苷酸 分子诊断方法 PCR反向点杂交 PCR RDB 法PCR RFLP法基因芯片法等 N D 1 2 3 4 6 5 8 7 10 9 11 二 血友病 人体的凝血过程需要多种凝血因子参加 由于凝血因子基因的缺陷而使其中某一凝血因子蛋白表达降低或缺如即造成血友病 hemophilia 85 的血友病患者是由于血浆中缺乏凝血第8因子 F 所致 约10 的患者是由于缺乏凝血第9因子 F 前者称为甲型血友病 后者称为乙型血友病 一 甲型血友病及其分子诊断 甲型血友病是由于凝血因子 F 即抗血友病球蛋白 antihemophilicglobulin AHG 缺乏
12、所导致的凝血机制异常的遗传性疾病 2 甲型血友病的分子机制 在F 基因区域内 有一种A基因存在三个拷贝 其功能不详 其中一个A基因位于F 基因的第22号内含子内 A1 另外两个位于X染色体的末端 A2 A3 A1基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组 引起F 基因的1 22外显子片段倒位 这种倒位导致F 功能完全丧失而发生严重的血友病 甲型血友病分子诊断 1 基因倒位的检测由于50 左右的甲型血友病是由于F 基因中的22号内含子倒位引起的 所以检测该突变成为对患者进行基因诊断的首选方法 在检测基因倒位的方法中首选的是长距离PCR LD PCR 技术 2 非基因倒位的检测点突变是非
13、基因倒位引起甲型血友病的主要原因 因此对该类患者的家系分析和携带者的基因检测主要是通过点突变的检测技术进行 1 PCR RFLP法2 VNTR法3 STR法4 PCR SSCP法 二 乙型血友病及其分子诊断 乙型血友病 又称Christmas病或血浆凝血活酶成分 plasmathromboplastincomponent PTC 缺乏症 是凝血因子 F 缺陷所致的一种严重的遗传性出血性疾病 分子机制为编码F 基因缺陷 导致F 含量缺乏或结构异常 从而凝血功能障碍 临床表现与甲型血友病完全相似 分子诊断直接测序法 基因芯片法和毛细管电泳 capillaryelectrophoresis CE 间
14、接检测方法有 RFLP法 SSCP法 DGGE法 双脱氧指纹图谱 dideoxyfingerprint ddF 变性高效液相色谱法 denaturinghighperformanceliquidchromatography DHPLC 三 肌营养不良症 肌营养不良症又称为假性肥大性肌营养不良 主要有杜氏肌营养不良症 Duchennemusculardystrophy DMD 和贝氏肌营养不良症 Beckermusculardystrophy BMD 它们是一种常见的X连锁性隐性遗传病 因此患者都为男孩 发病机制 主要为抗肌萎缩蛋白基因 dystrophingene 的突变导致肌细胞膜上的抗肌萎
15、缩蛋白 dystrophin 发生结构和功能的改变所致 Dystrophin是抗肌萎缩蛋白基因 DMD基因 的产物 当DMD基因突变后Dystrophin合成缺乏 该复合物无法有效形成 使细胞膜不稳定 最终造成肌细胞因通透性增加而变性或坏死 导致DMD的发生 2 杜氏和贝氏肌营养不良症的分子诊断 1 多重PCR技术 2 短串联重复序列 shorttandemrepeat STR 连锁分析 3 定量PCR技术 4 RT PCR技术 四 苯丙酮尿症 PKU是由挪威科学家Folling发现的 当时被命名为 苯丙酮尿性智力发育不全 1937年Penrose和Quastel将之命名为苯丙酮尿症 phen
16、ylketonuria PKU 其主要是由于肝内苯丙氨酸羟化酶 phenylalaninehydroxylase PAH 严重缺失所致的苯丙氨酸代谢异常 为常染色体隐性遗传病 二 苯丙酮酸尿症的分子诊断 1 PCR STR连锁分析2 PCR SSCP法3 PCR RFLP4 多重ASPCR法 五 囊性纤维化 cysticfibrosis CF CF是由囊性纤维化穿膜传导调节因子 cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator CFTR 基因突变所致 为白种人中最常见一种家族常染色体隐性遗传性先天性致死性疾病 多累及儿童和青年 发病率以西 北欧及北美人群为高 CF常累及胃肠道和呼吸道 极易发生呼吸道感染而引起气道梗阻及呼吸功能不全 多数病人仅能成活数年到十余年 CF分子机制 CFTR基因突变已达1000余种 已知的CF突变在CFTR基因中的分布是非随机的 绝大多数集中于编码CFTR蛋白NBFs区的外显子9 10 11 12 19 20 21 22 跨膜区的外显子3 4 7 14a 14b 17b以及R区的第13外显子 其中除 F508及另外
