《变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）（22页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、实验四 变性梯度凝胶电泳 DGGE 和温度梯度凝胶电泳 TGGE 一 实验原理一 实验原理 变性梯度凝胶电泳 denatured gradient gel electrophoresis DGGE 最初是 Lerman 等人 于 20 世纪 80 年代初期发明的 起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变 20 42 52 53 Muyzer 等人在 1993 年首次将其应用于微生物群落结构研究 50 后来又发展出其衍生技 术 温度梯度凝胶电泳 temperature gradient gel electrophoresis TGGE 49 此后十年间 该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个
2、领域 目前已经发展成为研究微生物群落结 构的主要分子生物学方法之一 49 51 1 原理 原理 双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时 其迁移行为决定于其分子大小和电荷 不同长度的 DNA 片段能够被区分开 但同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样 因 此不能被区分 DGGE TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上 加入了变性剂 尿素和 甲酰胺 梯度或是温度梯度 从而能够把同样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来 一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成 其序列组成决定了其解链区域 melting domain MD 和解链行为 melting behavior 20 42
3、一个几百个碱基对的 DNA 片段一般有几 个解链区域 每个解链区域有一段连续的碱基对组成 图 1 当温度逐渐升高 或是变性 剂浓度逐渐增加 达到其最低的解链区域温度时 该区域这一段连续的碱基对发生解链 当 温度再升高依次达到各其他解链区域温度时 这些区域也依次发生解链 直到温度达到最高 的解链区域温度后 最高的解链区域也发生解链 从而双链 DNA 完全解链 图 1 显示的 是一个 234bp 长的 DNA 片段的解链区域 横坐标是该 DNA 片段的序列 依次从第一个碱 基到第 234 个碱基 纵坐标是解链温度 该 DNA 片段共有 3 个解链区域 MD1 是解链温度 最低的一个解链区域 MD3
4、 是温度最高的一个解链区域 MD1 MD2 MD3 图1 DNA片段解链区域示意图 不同的双链 DNA 片段因为其序列组成不一样 所以其解链区域及各解链区域的解链温 度也是不一样的 当它们进行 DGGE TGGE 时 一开始温度 或变性剂浓度 比较小 不 能使双链 DNA 片段最低的解链区域解链 此时 DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰 胺凝胶中一样 然而一旦 DNA 片段迁移到一特定位置 其温度 或变性剂浓度 刚好能使 双链 DNA 片段最低的解链区域解链时 双链 DNA 片段最低的解链区域立即发生解链 部 分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低 因此 同样长度但序列不同的
5、DNA 片 段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度 因此它们会在胶中的不同位置处 发生部分解链导致迁移速率大大下降 从而在胶中被区分开来 然而 一旦温度 或变性剂浓度 达到 DNA 片段最高的解链区域温度时 DNA 片段 会完全解链 成为单链 DNA 分子 此时它们又能在胶中继续迁移 因此如果不同 DNA 片 段的序列差异发生在最高的解链区域时 这些片段就不能被区分开来 在 DNA 片段的一端 加入一段富含 GC 的 DNA 片段 GC 夹子 一般 30 50 个碱基对 可以解决这个问题 含有 GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处 它的解链温度很高 可
6、以 防止 DNA 片段在 DGGE TGGE 胶中完全解链 当加了 GC 夹子后 DNA 片段中基本上每 个碱基处的序列差异都能被区分开 52 53 当用 DGGE TGGE 技术来研究微生物群落结构时 要结合 PCR polymerase chain reaction 扩增技术 用 PCR 扩增的 16S rRNA 产物来反映微生物群落结构组成 通常根据 16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物 其中一个引物的 5 端含有一段 GC 夹 子 用来扩增微生物群落基因组总 DNA 扩增产物用于 DGGE TGGE 分析 DGGE TGGE 有两种电泳形式 垂直电泳和水平电泳 前者是
7、指变性剂梯度或温度梯度 的方向和电泳方向垂直 后者是指两个方向是平行的 在分析微生物群落的 PCR 扩增产物 时 一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围或温度范围 垂直电泳时 胶从左到 右是变性剂梯度或温度梯度 图 2 在胶的左边 变性剂浓度或温度低 DNA 片段是双链 形式 因此沿着电泳方向一直迁移 在胶的另一边 由于变性剂浓度或温度高 DNA 一进 入胶立刻就发生部分解链 因此迁移很慢 在胶的中间 DNA 片段有不同程度的解链 在 变性剂浓度或温度临界于 DNA 片段最低的解链区域时 DNA 的迁移速率有急剧的变化 因此 DNA 片段在垂直胶中染色后呈 S 形的曲线 如图 2 所示
8、根据垂直电泳确定的范围 再用水平电泳来对比分析不同的样品 如图 3 所示 图2 垂直胶 太原焦化厂活性污泥 16S rDNA V3区PCR扩增产物 图3 水平胶 太原焦化厂两 个嚗气池活性污泥16S rDNA V3区扩增产物 在用水平电泳分析样品之前 先要优化确定电泳所需时间 一般采用时间间歇 time travel 的方法 即每隔一定时间加一次样品 从而使样品的电泳时间有一个梯度 如图 4 所示 根据这个结果 确定最佳的电泳时间 图4 时间间歇 time travel 太原焦化厂 活性污泥16S rDNA V3区PCR扩增产物 通过各种染色方法可以看到 DGGE TGGE 胶中的 DNA 条
9、带 最常用的几种染色方法是 溴化乙啶 ethidium bromide EB 51 SYBR Green I 51 SYBR Gold 68 和银染法 66 EB 法染色的灵敏度最低 SYBR Green I 和 SYBR Gold 相比 EB 能更好地消除染色背景 因此它们的检测灵敏度比 EB 法高很多 EB 和 SYBR 染色时 双链 DNA 能很好地显色 单链 DNA 基本上不能显色 银染法的灵敏度最高 它不但能染双链 DNA 也能染单链 DNA 但它的缺点是不能用于随后的杂交分析 51 2 PCR DGGE TGGE 在微生物生态学中的应用在微生物生态学中的应用 PCR DGGE TG
10、GE 技术在微生物生态学中的一个主要用途是分析微生物群落结构组 成 Muyzer 等人于 1993 年首次将该技术用于研究微生物菌苔和生物膜系统的群落多样性 50 此后 该技术被广泛应用于各微生物生态系统 包括土壤 24 27 72 活性污泥 13 87 人体和动物肠道 71 94 温泉 18 植物根系 72 海洋 76 淡水湖 69 油藏 86 等 绝大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的 16S rRNA 基因来研究各生态系统中的 细菌或古细菌群落多样性 也有用真菌的通用引物扩增 18S rRNA 基因 24 从而研究真菌 的群落多样性 除了通过核糖体 RNA 基因来分析微生物群落结构外 还
11、可以通过扩增功能基因来研究 功能基因及功能菌群的多样性 氨单加氧酶 ammonia monooxygenase gene amoA 基因被用来研究氨氧化菌群 54 NiFe 氢化酶基因被用来研究硫酸盐还原菌群 88 多组 分苯酚羟化酶大亚基基因 the largest subunit of the multi component phenol hydroxylase LmPH 被用来研究降酚菌群 87 91 PCR DGGE TGGE 技术的另一大优点是能快速同时对比分析大量的样品 因此它既可 以对比分析不同的微生物群落之间的差异 也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环境 压力的变化过程 4
12、9 51 除了上述两个主要用途外 PCR DGGE TGGE 技术还有很多其他用途 它可以跟踪监 测细菌的富集和分离 从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响 67 85 可以检 测单个纯菌 rRNA 基因的微异质性 55 可以用来比较不同的 DNA 提取方法 51 另外 它还可以辅佐筛选克隆文库 39 以及检测 PCR 和克隆过程中的偏差 37 我们实验室用 PCR TGGE 技术研究了多个微生物生态系统的微生物群落 包括处理工 业焦化废水的活性污泥系统 92 95 人体肠道 89 动物肠道 猪 熊猫 昆虫 人体 口腔 纤维素降解土壤 油藏系统等 另外 我们还研究了处理工业焦化废水的活性
13、污泥系 统中苯酚降解菌群 91 和氨氧化菌群的功能基因多样性 3 DGGE TGGE 技术的缺陷及优化技术的缺陷及优化 在用分子生物学方法分析微生物群落结构组成时 有很多偏差 不同细菌的基因组大 小和核糖体 RNA 拷贝数不同 16 提取基因组总 DNA 时细胞的裂解效率不同 59 DNA 提取和纯化时有偏差 43 44 PCR 扩增过程中有偏差 34 61 63 除了这些 在应用 DGGE TGGE 技术分析微生物群落结构组成时还有很多其他的缺陷 DGGE TGGE 一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段 52 因此得到的系统进化 相关的信息就很少 在研究复杂环境生态系统 如土壤
14、 人体肠道 时 其中微生物种类很多 但 DGGE TGGE 图谱中一般只有一二十个条带 这些条带反映的是群落中的优势菌群 一般只有在总的微生 物群落中占 1 以上的种群才能被检测出来 50 系统中的弱势菌群不能被检测到 为了降 低分析群落多样性时的复杂度 一种方法是先根据 GC 含量的不同 将基因组总 DNA 分成 各个部分 再分别 PCR DGGE TGGE 分析 28 另一个方法是使用类群特异性 group specific 引物对基因组总 DNA 进行 PCR 扩增 再用于 DGGE TGGE 分析 39 56 在设计 PCR 引物去扩增某些特定菌群时 由于某些菌群的序列相互之间同源性不
15、是很 高 因此需要设计简并性引物 此时 相同的微生物会有 2 个条带 这会对微生物群落结构 组成造成高估 39 另外 同一个细菌也可以有多个核糖体 RNA 操纵单元 它们的序列可 以有微小差异 55 这也会高估微生物群落多样性 DGGE 的电泳条件不一样 即使相同的样品所得的图谱也会有差异 70 在应用 DGGE 时 如果所用电压太低 需要的电泳时间就很长 变性剂梯度会有变化 因此导致图谱也会 有变动 另外 DGGE TGGE 的一个很大的优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究 得到它 们的序列 从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化信息 以前研究 DGGE TGGE胶中单一
16、条带序列组成的一个比较普遍的方法是先构建整个微生物群落的16S rRNA 克隆文库 然后再对文库中的克隆进行扩增 通过 DGGE TGGE 和原始样品的条带进 行对比 能迁移到相同位置处的克隆的序列就是原始条带所含的序列 94 然而 已有研 究表明 不同的 DNA 条带在 DGGE TGGE 胶中可以迁移到相同的位置 32 39 68 82 因 此单一 DGGE TGGE 条带可能含有不止一种序列 这种情形在分析复杂环境样品时会更多 另一个研究 DGGE TGGE 胶中单一条带序列组成的方法是直接从胶中回收 DNA 然后构建 其克隆文库 再对其中的克隆进行测序 39 68 74 现在越来越多的研究人员采用后一种 方法 然而 PCR 过程中产生的异源双链 heteroduplex 和单链 DNA single stranded DNA 也会对分析单一条带序列造成偏差 人们已经普遍意识到异源双链 DNA 会在 DGGE TGGE 胶中产生虚假条带 19 73 然而对单链 DNA 造成的偏差还没有引起足够的重视 38 74 我们实验室以某处理工业焦化废水的活性污泥为研究对象 详细地分析了单链
