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1、Validation of Analytical Procedure 分析方法验证 徐禾丰 第二部分 实验设计与操作 第 2 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 1 0 讲座目的 掌握验证试验设计 掌握验证试验操作 了解确定接受标准原则 第 3 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 0 精密度 概念 容易混淆的精密度中术语 重复性 中间精密度 推荐重复性接受标准 AOAC浓度与精密度关系 重现性 第 4 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 1 概念1 精密度 ICH Q2定义 分析方法的精密度指在规定条件下 对均质样品 多次 取样进行一系列检测结果的接近程度 离散程度
2、第 5 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 2 容易混淆的精密度中术语 仪器重复性 相同人员 仪器 日期 标准液 方法重复性 相同人员 仪器 日期 重新配制标准液 中间精密度 不同日期 不同分析人员 不同仪器 第 6 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 3 重复性 概念 推荐重复性测定方法 第 7 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 3 1 概念2 重复性 ICH Q2定义 重复性是指在同样的操作条件下 较短时间间隔的精 密度 第 8 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 3 2 推荐重复性测定方法 在方法规定的线性范围内重复测定 如3个浓度 每个浓度3次
3、 或100 的测试浓度 测定六次 记录每次测定各组分响应 计算各响应值与平均值之间相对标准偏差 第 9 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 3 2 1 概念3 系统重复性 相同条件下 同一分析人员对同一样品溶液多次测试 结果的接近程度 第 10 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 3 2 2 系统重复性实验 取同一均匀标准样品溶液 连续重复测定六次 记录每次测定各组分响应 计算各响应值与平均值之间相对标准偏差 第 11 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 3 2 3 概念4 方法重复性 相同条件下 同一个分析人员对同一个均匀样品 多次 取样测定所得结果的接近程度
4、第 12 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 3 2 4 方法重复性实验 取同一批号均匀样品 按照分析方法规定至少称量出六份 按含量测定方法测定每一份样品含量 计算每一次测定的含量与平均含量之间的相对标准偏 差 第 13 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 4 中间精密度 概念 推荐中间精密度测定方法 第 14 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 4 1 概念5 中间精密度 ICH Q2定义 中间精密度指的是试验室内部条件改变 如 不同日 不 同分析者 不同仪器等情况下的精密度 第 15 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 4 2 推荐中间精密度测定方法
5、 应确定随机事件对分析方法精密度的影响 如不同日期 不同分析人员 不同仪器等等 没有必要一一考察 用均匀设计 或正交设计方法 第 16 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 5 推荐重复性接受标准 系统重复性 S N 1000 RSDS N 100 RSDS N 10 RSD 4 S N 10 RSD 8 方法重复性 测定结果的相对标准偏差 仪器分析小于2 容量分析小于0 3 第 17 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 6 AOAC浓度与精密度关系 301 ppb10 90 0000001 2110 ppb10 80 000001 15100 ppb10 70 00001
6、111 ppm10 60 0001 7 310 ppm10 50 001 5 3100 ppm10 40 01 3 70 1 10 3 0 1 2 81 10 2 1 2 710 10 1 10 1 3100 1100 RSD 单位比率浓度 第 18 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 7 重现性 概念 什么时候需要作重现性 第 19 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 7 1 概念6 重现性 ICH Q2定义 重现性指不同试验室之间的精密度 第 20 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 2 7 2 什么时候需要作重现性 是比较实验室间的差异 当一个方法要升级到法规方
7、法时 需要做这个工作 第 21 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3 0 准确度 概念 原料药准确度测定 制剂产品准确度测定 杂质准确度测定 推荐准确度测定方法 推荐准确度测定接受标准 AOAC浓度与回收率关系 第 22 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3 1 概念7 准确度 ICH Q2定义 分析方法的准确性指的是真实值或认可的参考值与测 量值之间相近程度 第 23 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3 2 原料药准确度测定 用该方法分析已知纯度的分析物 该方法的分析结果与成熟的分析方法相比较 该成熟方 法准确度是已知的 在精密度 线性 专属性建立后 进行推论 第
8、24 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3 3 制剂准确度测定 用该方法去测按处方量制成的混合物 加入已知量被 测物 在制剂中加入已知量主药或与另一成熟方法比较 在精密度 线性和专属性建立后得出 第 25 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3 4 杂质准确度测定 在样品 原料 制剂 中加入已知量的杂质 无法得到杂质 降解物的 与采用其他方法测得的结果 比较 可以使用原料的响应值 第 26 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3 5 推荐准确度测定方法 在六个空白样品中 分别加入已知浓度的样品 浓度范 围为含量测定浓度的80 120 计算该方法的百分回收率 第 27 页人用
9、药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3 6 推荐准确度测定接受标准 测定得到的主品的百分回收率与理论回收率100 间 的相对标准偏差不得大于方法重复性相对标准偏差的 4倍 第 28 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 3 7 AOAC浓度与回收率关系 40 1201 ppb10 90 0000001 60 11510 ppb10 80 000001 80 110100 ppb10 70 00001 80 1101 ppm10 60 0001 80 11010 ppm10 50 001 90 107100 ppm10 40 01 95 1050 1 10 3 0 1 97 1031 10
10、2 1 98 10210 10 1 10 98 102100 1100 平均回收率 单位比率浓度 第 29 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 4 0 检测限 概念 直观法 信噪比法 标准偏差和斜率法 推荐检测限测定方法 第 30 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 4 1 概念8 检测限 ICH Q2定义 检测限度指的是样品中的被分析物质能够被检测到的 最低量 但不一定要准确定量 第 31 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 4 2 直观法 直观评价可以用于非仪器分析方法 也可用于仪器分析 方法 检测限的测定是通过对一系列已知浓度被分析物的样 品进行分析 并以能准确 或被可
11、靠 地检测被测物的最 小量或最低浓度来建立 第 32 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 4 3 信噪比法 用于能显示基线噪音的分析方法 把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出 的信号进行比较 算出能被可靠地检测出的最低浓度或量 一般以信噪比为3 1 或2 1 时相应的浓度或注入仪器 的量确定检测限 第 33 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 4 4 标准偏差和斜率法 根据响应值的标准偏差和斜率 检测限度 DL 3 3 s 响应值的标准偏差 通过空白样品测背景响 应值或Y轴截距 s 校正曲线的斜率 通过被测物的校正曲线求 得 第 34 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰
12、4 5 推荐检测限测定方法 在最灵敏的仪器状态下 测定至少四个空白样品 洗脱时间需覆盖整个样品中所有组分的流出 计算平均噪声水平 然后按信噪比大于2而小于6配制所有组分的样品溶液 每个样品进样三次 计算该组分的最小检测限 第 35 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 5 0 定量限 概念 推荐定量限测定方法 第 36 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 5 1 概念9 定量限 ICH Q2定义 某种分析方法的定量限度是指具有合适准确性和精密 度的条件下 能够定量测定分析组分的最低限量 它 是样品中含量低的化合物定量分析的参数 特别适用 于杂质和 或 降解产物的测定 第 37 页人用
13、药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 5 2 推荐定量限测定方法 按检测限方法测定仪器的平均噪声 然后按信噪比等于10 0 0 5配制样品溶液 连续进样三次 计算组分的最小定量限 第 38 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6 0 耐用性 概念 变动因素 色谱分析中耐用性项目 第 39 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6 1 概念10 耐用性 ICH Q2定义 分析方法的耐用性是指试验参数适当地发生细小改变 时 测量能力保持不受影响 可用于说明正常使用时的 可靠性 第 40 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6 2 变动因素 典型液相色谱法变动因素 流动相的组成 pH值
14、 不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱 柱温 流速等 第 41 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6 2 变动因素 典型气相色谱法变动因素 载气 流速 不同厂牌或批号的色谱柱 固定相 担体 柱温 进样口 检测器温度 第 42 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 6 3 色谱分析中耐用性项目 流动相组成 HPLC 不同的柱 温度 流量 样品制备操作 所有分析 提取时间 变量分析方法 流量 温度 不同的柱 GC 第 43 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7 0 线性度 概念 线性范围 推荐线性度测定方法 推荐线性度测定接受标准 第 44 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰
15、 7 1 概念11 线性度 ICH Q2定义 分析方法的线性是指在给定的范围内检测结果与样品 中被分析物的浓度 含量 成比例关系的能力 第 45 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7 2 概念12 线性范围 ICH Q2定义 分析方法的范围是指在样品中被分析物的较高浓度 量 和较低浓度 量 之间的区间 并已证实区间内 该方 法具有合适的准确性 精密度 线性 第 46 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7 3 推荐线性度测定方法 在含量测定浓度的70 130 或50 150 均匀选择 至少六个不同的浓度点 每一个尝试至少需测定四次 记录各对应浓度下的相应响应值 第 47 页人用药
16、注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 7 2 推荐线性度测定接受标准 相关系数应当在0 999与1 000之间 经线性回归处理 其截距不应明显地偏离零点 第 48 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8 0 专属性 概念 推荐专属性测定方法 降解研究内容 第 49 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8 1 概念13 专属性 ICH Q2定义 专属性是指在一些可能存在的组分 如杂质 降解物 基 质等存在时 对被分析物准确可靠测定的能力 第 50 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8 1 推荐专属性测定方法 按照规定的标准或参考文献的色谱分析方法 分别将原料药 中间体 可得到杂质 原料 中间体 前体 及降解产物的样品分别进样 记录各物质的相对保留时间 确保各样品之间的峰可以分开 至少确保其他物质的峰与主峰分开 第 51 页人用药注册技术要求国际协调会议 徐禾丰 8 2 概念14 稳定性指示性分析方法 FDA定义 稳定性指示性分析方法是一种验证了的定量分析方法 其能够测定原料药或药品在有关性质的变化 一个稳定性指示性分析能在没有降解产物 工艺杂质 辅助材料或其他的杂质干扰下
