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1、离子色谱在药品检验中的应用与展望 山东省药品检验所化学药品科凌霄2010年10月25日 离子型物质 在水溶液中电离 具有 或 电荷的元素阴离子 Cl NO2 SO42 CrO42 阳离子 Na NH4 Ca2 Fe3 Mg2 离子色谱 利用色谱技术测定离子型物质的方法 20世纪40年代20世纪60年代末Novelionexchangechromatographicmethodusingconductimetricdetection HamishSmall et al Anal Chem 1975 47 11 1801 中国药典 2010年版二部附录 J 内容 1 离子色谱的分离方式及机理2 流
2、动相3 抑制器4 检测器5 离子色谱在医药及药检领域的应用 离子排斥色谱 HPIEC 无机弱酸和有机酸 醇 醛 氨基酸和糖类的分离离子对色谱 MPIC 分离金属络和物和表面活性阳离子 阴离子 高效离子交换色谱 HPIC 亲水性阴 阳离子的分离 分离的方式 Temporalcourse 离子交换分离过程 分离阴离子 Column IonPacAG12A AS12AEluent 2 7mMNa2CO30 3mMNaHCO3Flowrate 1 2mL minDetection Conductivity ASRSRecyclemode 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Retentiont
3、ime min 0 8 mS 影响离子保留的因素 离子色谱法中用分配系数 指在固定相和流动相中的浓度比 来描述离子的色谱保留行为 不同离子分配系数的差异是色谱分离的基础 影响因素有流动相流速 分离柱长度 柱温 固定相性质 流动相的种类与浓度 流动相的pH等 离子排斥色谱法的分离假说 Donnan排斥作用吸附空间排阻 Donnanmembrane 固定相 流动相 离子排斥分离机理 Column IonPacICEAS1Eluent 0 4mMOctonesulfonicacidFlowrate 1 0mL minSuppressor AMMS ICE Regeneratorliquid 5mMT
4、BAOH 50mMH3BO3Detection Conductivity 离子排斥法分离有机酸 20 10 0 保留时间 min 0 S 5 1 2 3 4 5 1 甲酸2 乙酸3 丙酸4 丁酸5 戊酸 离子对的分离机理 1 生成离子对 待测离子与离子对试剂生成中性 离子对 分布于固定相与流动相之间 其分离类似传统的反相分离2 动态离子交换 离子对试剂的疏水部分吸附于固定相形成动态的离子交换表面 其分离机理类似于离子交换 3 离子间相互作用 除包括以上两种分离机理和固定相表面双电层结构的分离机理 MobilephaseTBAOH ACN H2OSampleY X 固定相 TBA OH Y X
5、Y X TBA X TBA X TBA X TBA X TBA OH ACN ACN ACN ACN ACN ACN ACN TBA OH TBA OH 疏水相 亲水相 离子对分离机理 Y OH Column IonPacNS1 NG1Eluent 2mMTBAOH 24 48 CANgradientin10minFlowrate 1 0mL minDetection Conductivity suppressortype ASRSMPICMode Regenerator 10mNH2SO41 Methanesulfonicacid5 0 g mL ppm 2 1 Propanesulfoni
6、cacid8 63 1 Butanesulfonicacid8 74 1 Hexanesulfonicacid8 85 1 Heptanesulfonicacid8 96 1 Octanesulfonicacid8 97 1 Decanesulfonicacid9 1 0 Retentiontime min 12 16 8 S 0 0 4 8 0 反相离子对分离测定 离子色谱固定相 分离的核心抓住基础注重积累关注发展 离子色谱流动相选择的条件 有一定的洗脱能力 化学 物理性质稳定 与被测离子有一定的性质差异 对检测器响应值尽可能小 离子色谱使用的水与试剂 纯度尽可能高 高纯水 电阻率 17M
7、0 22 m滤膜过滤 流动相脱气 在线氦气脱气或超声 减压过滤离线脱气 冷冻方式脱气 试剂 尽可能使用优级纯 配标准的试剂应预先干燥 抑制型阴离子色谱的典型流动相 四硼酸钠 Na2B4O7 硼酸 H3BO3 氢氧根 NaOH 碳酸氢根 NaHCO3 碳酸根 Na2CO3 通常 作为流动相使用的化合物在水溶液中的pH大于8时为阴离子 pH在5 8之间为中性分子 其阴离子对固定相亲合力 与待测离子相近 这类化合物可作阴离子分析的流动相 流动相强度 阳离子交换流动相的选择 流动相有足够的电离 以提供阳离子的脱离 多价阳离子有更大的洗脱能力 洗脱离子半径越大 洗脱能力越强 与被测离子有足够大的电导差异
8、 对抑制电导法 抑制后流动相背景电导足够小流动相的背景较小较理想 酸或对应的弱碱对于有机胺类 加入有机改进剂 会减少保留时间并且改善峰形 阳离子交换所用的流动相 盐酸硝酸硫酸甲磺酸吡啶 2 6 二羧酸 离子排斥色谱常用流动相 主要作用 改变溶液的pH值 控制有机酸的离解最简单的是去离子水 对有机酸的分析 常用矿物酸 如HCl H2SO4 HNO3等 Ag 型阳离子交换剂作抑制器填料 HCl若用直接UV检测 H2SO4 混合流动相 流动相中添加有机溶剂 疏水性离子的吸附 分配 强流动相 弱流动相 淋洗强度的准确调节 流动相中有目的地添加特殊试剂 如 酒石酸 冠醚 用于钾钠分离 调节流动相强度和极
9、性 色谱柱 流动相的温度流动相的浓度与组成流动相的流速流动相中的杂质 影响色谱分析的各种条件 一价离子快速洗脱 0 2 4 6 8 10 12 14 20 25 30 35 40 45 Temp Retentiontime min 色谱柱 流动相的温度 流动相浓度vs 保留时间 0 4 8 12 16 20 8mM 9mM 10mM 11mM 12mM 13mM 浓度 Retentiontime min 流动相的组成vs 保留时间 0 4 8 12 16 20 0 0 11 0 22 0 33 Comp ratio NaHCO3 Na2CO3 Retentiontime min 10 0 S
10、0 ACN 20 ACN 50 ACN 1 2 3 4 5 6 7 0 10 Retentiontime min 10 10 0 0 S S 1 F 2 Cl 3 NO2 4 Br 5 NO3 6 HPO42 7 SO42 流动相中有机溶剂的影响 ExAS4A SCcolumn 流动相的流速VS 面积 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 0 5 1 1 5 2 Flowrate mL min Area 流速增加 流动相中杂质的影响 正常流动相 流动相被Cl沾污 流动相 泵 色谱柱 检测器 泵液 分离 检测 记录 进样阀 抑制器 检测池 进样 离子色谱的基本流程图
11、 废液 抑制器的作用 流动相 四元梯度泵 保护柱 离子色谱柱 抑制器 电导检测器 安装在电导池之前提高待测离子的电导率 提高灵敏度Na Cl H Cl 降低背景电导 流动相 减少噪音Na HCO3 H2CO3 Na OH H2O 抑制器 检测器 样品处理 过滤样品中除去颗粒物用0 45 m或0 22 m滤膜用高纯水冲洗滤膜 以减少沾污稀释待测物浓度较高时 应预先稀释 降低干扰物的浓度 去除干扰物预处理柱 超滤固相萃取 液相萃取 离心 盐析在线柱处理 在药检领域的应用 中国药典 2010年版新增品种糖类分析氨基酸分析 新增品种 帕米磷酸二钠氯膦酸二钠 帕米磷酸二钠PamidronateDisod
12、ium PamidronateDisodiumPentahydrate 帕米磷酸二钠 氯膦酸二钠ClodronateDisodium ClodronateDisodiumTetrahydrate 氯膦酸二钠 糖类分析的原理 在强碱溶液中呈离子化状态糖具有电化学活性 RocklinRD PohlCA JLiquidChromatoger1987 388 46 六种单糖标准溶液的离子色谱图 1 鼠李糖2 阿拉伯糖3 半乳糖4 葡萄糖5 木糖6 果糖 氨基酸分析 1样品不需衍生化处理 可直接分析 2灵敏度高 最小检测浓度可达ppb级 g L 常见的氨基酸如下 丙胺酸 精氨酸 天冬酰胺酸 天冬氨酸 半
13、胱氨酸 谷氨酰胺 谷氨酸 组氨酸 甘氨酸 异亮氨酸 亮氨基酸 赖氨酸 蛋氨酸 苯基丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 色氨酸 酪氨酸 颉氨酸 羟基赖氨酸 羟基脯氨酸 正亮氨酸 磺基丙氨酸 胱氨酸 甘氨酰基 氨基酸的分子结构 氨基酸分析的原理 氨基酸具有两性离子结构 在酸性介质中 以氨基阳离子状态存在 在碱性介质中 以羧基阴离子状态存在 这也是氨基酸分离分析方法的基础 在pH12 13 氨基酸与阴离子交换树脂之间的静电吸引的大小次序是酸性氨基酸 中性氨基酸 碱性氨基酸 因此氨基酸的洗脱顺序大体是碱性氨基酸 中性氨基酸和酸性氨基酸 AnIntegratedAmperometryWaveformfort
14、heDirect SensitiveDetectionofAminoAcidsandAminoSugarsFollowingAnion ExchangeChromatographyClarkeAP JandikP RocklinRD etal AnalChem 1999 71 2774Analyzingmixturesofaminoacidsandcarbohydratesusingbi modalintegratedamperometricdetectionJandikP ClarkeAP RocklinRD etal JChrom B 1999 732 193 色谱条件如下 分离柱 Ami
15、noPacPA10 2mm 250mm 流动相 0 25mol LNaOH 1 0mol LNaAc流速 0 25mL min进样体积 10 L温度 30 检测方式 积分脉冲安培检测器 IPAD Ag AgCl参比电极 金工作电极 氨基酸标准物质的离子色谱图 氨基酸直接分析方法的优点 1 一次进样分析氨基酸 氨基糖和碳水化合物2 无需柱前柱后衍生 直接阴离子或阳离子交换分离 积分脉冲安培检测3 简单 便宜的试剂 用氢氧化钠和醋酸钠为流动相4 可靠的定量 高的灵敏度5 最少的样品前处理 与常用的样品前处理方法匹配 总结 离子色谱法的特点 方便 快速灵敏度高选择性好 发展及方向 发展联用技术乳酸钠林格注射液口服补液盐散 谢谢
