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1、食 品 发 酵 工 程 概 论主讲教师 郑艳第四章 微生物的发酵方式与发酵工艺 第一节 微生物的发酵方式第二节 液态深层发酵工艺第三节 发酵产物的提取与精制第一节 微 生 物 的 发 酵 方 式 微生物的发酵方式根据发酵培养基的状态分:固态发酵,液态(液体深层)发酵,半固态发酵分批式发酵 连续式发酵 补料分批式发酵根据微生物对氧的需求分:好氧发酵,厌氧发酵第一节 微 生 物 的 发 酵 方 式 分批式发酵概念:在发酵过程中,除了不断进行通气(好氧发酵),调节发酵液 pH 外与外界没有其它物料交 换的一种发酵方式.培养基的一次性加入,产品一次性收获.特点:操作简单,周期短,染菌机会少,原料利用率
2、 高,但产率低.第一节 微 生 物 的 发 酵 方 式微生物的生长曲线:将少量单细胞纯培养接种的一恒定容积的新鲜液体培养基中,在适宜的条件下培养,定时取样测定细菌含量,如果以培养时间为横坐标,以细菌数目的对数为纵坐标作图,所得的曲线.分批发酵中微生物的生长状态第一节 微 生 物 的 发 酵 方 式 对数期特点:细菌数以几何级数增加,代时稳定,细菌数的增加与原生质量的增加及菌液浊度成正相关.代时:单个细胞完成一次分裂所需要的时间称为代时(不同菌种对数期的代时不同,同一种菌培养条件不同代时不同)问题:发酵工业选择那个时期的微生物细胞作为种子 第一节 微 生 物 的 发 酵 方 式 稳定期特点:新增
3、殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等,二者处于动态平衡.衰亡期特点:活菌数以几何级数下降,细胞开始自溶.思考题诱变育种中应选择那个时期的细胞进行处理 为什么 发酵工业中产物的收获应在那个时期 为什么 第一节 微 生 物 的 发 酵 方 式 连续式发酵概念:连续不断的向发酵罐中流加新鲜发酵液,同时又连续不断的排出等量的发酵液,从而使 pH, 养分,溶解氧保持恒定,使微生物生长和代谢活动保持旺盛稳定的状态的一种发酵方式.特点:可以使发酵过程最优化,便于自动化控制.但长期连续培养易引起 菌种退化.第一节 微 生 物 的 发 酵 方 式 补料分批发酵概念:在整个发酵过程中只有料液的加入没有料液的取出.通
4、过补入新鲜的料液,以克服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点.特点:由于没有物料的取出,产物的积累最终导致产物合成速率的下降,同时增加了染菌的机会.第二节 液态深层发酵工艺种子扩大培养的目的与要求种子制备实例种子制备的技术概要种子扩大培养是指将保存在砂土管,冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后,再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程.这些纯种培养物称为种子.种子扩大培养的目的与要求种子扩大培养的概念种子扩培的目的接种量的需要菌种的驯化缩短发酵时间,保证生产水平种子的要求:总量及浓度能满足要求生理状况稳定,个体与群体活力强,移种至发酵后,能够迅速生长无
5、杂菌污染种子制备过程举例谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种一级种子培养二级种子培养发酵1,斜面 (AS1.299)培养基:蛋白胨 1%,牛肉膏 1%,氯化钠 0.5琼脂 2%, pH 7.0-7.2培养基特点:有利于菌体的生长,原料比较精细培养条件:32,生长 18-24 小时生长斜面要求:生长良好,所使用斜面连续传代不超过3 次2. 一级种子(摇瓶)培养条件:于 1000ml 三角瓶中,装液 200-250ml,32培养 12 小时.培养基:葡萄糖 2%,尿素 0.5%,玉米浆 2.5%, K2HPO4 0.1%培养基特点:有利于菌体的生长,所使用的原料已经基本接近于发酵培养基3. 二级种
6、子(种子罐)培养条件:在种子罐中培养(容积为发酵罐的 1%),32培养 7-10 个小时培养基:和一级种子相似,其中葡萄糖用水解糖代替,浓度为 2.5%培养基的特点:长菌体,更接近于发酵培养基种子的质量要求:108-109 个/ml大小均匀,呈单个或八字排列PH 7.0-7.2 时结束,6.887.0-7.2活力旺盛制备过程安培管 斜面孢子 大米孢子 一级种子 二级种子 发酵种子制备过程举例青霉素生产的种子制备一,斜面孢子培养基:甘油, 葡萄糖, 蛋白胨等培养基特点:有利于长孢子,用量少而精细培养条件:25,7 天, 注意湿度 50%左右二,大米孢子培养基:大米及氮源(玉米浆)培养基的特点:成
7、本低,米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质,营养适当(要求大米的白点小)有利于孢子的生长.培养条件:25,7 天,控制湿度大米孢子的要求:1 粒米含 1.4*106 个孢子3,一级种子培养基:(葡萄糖,乳糖,蔗糖),玉米浆目的:长菌体培养条件:27,40 小时接种量:200 亿孢子/吨4,二级种子培养基:同上培养条件:27,10-14 小时接种量:10%种子的质量要求菌丝长稠呈丝状,菌丝团很少,有中小空孢,处于期青霉素发酵菌丝体的生长共分为 6 个期,1-4 为年青期,4-6 期合成青霉素的能力最强种子制备的技术概要种子制备的过程实验室阶段:不用种子罐,所用的设备为培养箱,摇床等实验室常见设
8、备,在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成,因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养.生产车间阶段:种子培养在种子罐里面进行,一般在工程归为发酵车间管理,因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段.实验室阶段1,培养物选择的原则目的:种子扩培到一定的量和质,根据菌种的特点最终的培养物可分为两类:对于不产孢子和芽胞的微生物获得一定数量和质量的菌体对于不产芽孢和孢子的微生物,实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体,如谷氨酸的种子培养.获得一定数量和质量的孢子菌丝体培养步骤少,因而更容易获得量和质稳定的种子,但操作繁琐.对于产孢子的微生物获得一定数量和质量的菌丝体便于操作,但需要更仔细
9、的控制.2,培养基选择的原则培养基的选择应该是有利于菌体的生长,对孢子培养基应该是有利于孢子的生长.在原料方面,实验室种子培养阶段,规模一般比较小,因此为了保证培养基的质量,培养基的原料一般都比较精细.3,起始接种物的传代问题细菌保藏斜面 活化斜面产孢子保藏 母斜面 子斜面目的:使菌种的传代次数尽可能的少.母瓶:活化,纯化,使保藏菌种生长,并去处变异株.所以接种时要稀一点,便于纯化生长到单菌落.子瓶: 大量繁殖,得到大量孢子.接种:从母斜面上点接种,选取生长好的单菌落接种时密一点,得到大量的孢子.孢子培养时注意湿度,子斜面使用一般不超过 1 个月孢子培养生产车间阶段1,培养物的选择原则在生产车
10、间阶段,最终一般都是获得一定数量的菌丝体.缩短发酵时间有利于获得好的发酵结果菌丝体比孢子要有利:2,培养基选择的原则目的:获得一定数量和质量的菌体,因此培养基的选择应首先考虑的是有利于孢子的发育和菌体的生长,所以营养要比发酵培养基丰富.在原料方面:不如实验室阶段那么精细,而是基本接近于发酵培养基,这有两个方面的原因:一是成本 二是驯化例:柠檬酸发酵以蔗糖为原料成分 斜面 种子罐 发酵麦芽汁 麦汁 蔗糖 2.5-5% 20%NH4NO3 0.225% 0.11%K2HPO4 0.03% MgSO4.H2O 0.025% 0.025% KCl 0.015%琼脂 2%薯干粉成分 斜面 种子罐 发酵麦
11、芽汁 麦汁 薯干粉 10% 22-28%(NH4)2SO4 0.5%琼脂 2%3,发酵级数的确定谷氨酸:三级发酵一级种子(摇瓶)二级种子 (小罐)发酵青霉素:三级发酵一级种子 (小罐)二级种子(中罐)发酵一般由菌丝体培养开始计算发酵级数,但有时,工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数发酵级数确定的依据级数受发酵规模,菌体生长特性,接种量的影响级数大,难控制,易染菌,易变异,管理困难,一般 2-4 级.在发酵产品的放大中,反应级数的确定是非常重要的一个方面4,接种量的确定移入种子的体积接种量= 接种后培养液的体积过大过小都不好,最终以实践定,如大多数抗生素为 7-15%.但是一般认为大一点好.双种:
12、两个种子罐接种到一个发酵罐中.倒种:一部分种子来源于种子罐,一部分来源于发酵罐. P 1475,种龄种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间.种龄短:菌体太少;种龄长:易老化.原则:对数生长期末,细胞活力强,菌体浓度相对较大,但是最终由实验结果定.6,种子的质量要求:量:要求达到一定的浓度质: 形态 (生长处于某个阶段,均匀等等)理化指标:C,N,P 的含量,pH酶活等 无污染读书报告:种子质量的控制方法,以及种子质量对发酵的影响要求:1. 针对具体的产品2. 注意与上课的内容联系3. 4 月 5 号交(文本,一定标注参考文献)第三节 发酵产物的提取与精制发酵产物的分
13、类菌体,酶,代谢产物下游加工过程的特点成分复杂;产品浓度低;收率低;失活问题;不稳定性;生物安全性.第三节 发酵产物的提取与精制下游加工过程设计应遵循的基本原则时间短温度低pH 适中清洁卫生生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作培养液(发酵液)的预处理和固液分离;初步纯化(提取);高度纯化(精制);成品加工. 1. 一般下游加工过程可分为 4 个阶段第三节 发酵产物的提取与精制(沉淀,吸附,萃取,超滤,结晶)发酵液初步纯化细胞碎片分离细胞破碎细胞分离高度纯化成品加工预处理胞外产物(加热,调 pH,絮凝)(过滤,离心分离,膜分离)(匀浆,研磨,酶解)(离心分离,双水相萃取,膜分离)(重结晶,离
14、子交换,色谱分离,膜分离)(浓缩,无菌过滤,干燥,成型)胞外产物提取精制第三节 发酵产物的提取与精制下游工艺过程决定于产品的性质和要求达到的纯度如为胞外产物则可省去细胞破碎步骤.如产品为菌体本身,则工艺比较简单,只需经过滤,得到菌体,再经干燥就可,如单细胞蛋白的生产.如可以从发酵液直接提取,则可省去固液分离步骤.3. 单元操作过滤,离心固液分离;蒸发,蒸馏,结晶进一步纯化;萃取浓缩或提取液相中的成分;离子交换,层析,膜技术,超滤;干燥第三节 发酵产物的提取与精制四,发酵产物提取与精制的过程1,对未知的发酵产品提取的步骤(1)确定发酵产物的类型(2) 确定发酵产物的稳定性1,含水量高,一般可达
15、90%99%2,产品浓度低3,悬浮物颗粒小,密度与液体相差不大4,固体粒子可压缩性大5,液体黏度大,大多为非牛顿型流体6,产物性质不稳定发酵醪的预处理发酵醪的一般特征发酵醪的预处理发酵醪预处理的目的(1)改变发酵液的物理性质,促进悬浮液中分离固形物的速度,提高固液分离器的效率.(2)尽可能使产物转入便于后处理的某一相中(多数是液体).(3)去除发酵液中部分杂质,以利于后续各步操作.发酵醪的预处理发酵醪预处理的要求(1)菌体的分离(2)固体悬浮物的去除(3)蛋白质的去除(4)重金属离子的去除(5)色素,热原质,毒性物质等有机杂质的去除(6)改变发酵醪的性质(7)调节适宜 pH 值和温度1,加热法
16、:降低悬浮液的黏度,除去某些杂蛋白,降低悬浮物的最终体积,破坏凝胶状结构,增加滤饼的空隙度不适用热敏性的物质2,调节悬浮液的 pH通过调节发酵醪 pH 到蛋白质的等电点使蛋白质沉淀,同时络合重金属离子;常用的酸化剂有草酸,盐酸,硫酸和磷酸发酵醪的预处理发酵醪预处理的方法3,凝聚和絮凝凝聚:在投加的化学物质(比如水解的凝聚剂,像铝,铁的盐类或石灰等)作用下,胶体脱稳并使粒子相互聚成 1mm 大小块状凝聚体的过程.凝聚剂的作用:有些是对初始粒子表面电荷的简单中和,另一些是消除双电荷层(采用中性盐例如 NaCl 等)而脱稳,还有些是通过氢键或其他复杂的形式与粒子相结合而产生凝聚发酵醪的预处理发酵醪预处理的方法絮凝:使用絮凝剂(通常是天然或合成的大分子量聚电解质)将胶体粒子交联成网,形成 10mm 大小絮凝团的过程.其中絮凝剂主要起架桥作用.凝聚剂和絮凝剂的种类:(1)凝聚剂:主要是无机类电解质,大多为阳粒子无机盐类:硫酸铝,
