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1、ICS65.150B 50DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX水生动物细菌性病原检测技术规范Inspection protocol for bacterial pathogens of aquatic animalsXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省农业农村厅提出并组织实施。本标准由山东省渔业标准化委员会（鲁TC03）归口。本标准起草单位：威海海洋
2、职业学院、山东省渔业技术推广站、中国科学院水生生物研究所、江苏省渔业技术推广中心、威海市渔业技术推广站。本标准主要起草人：侯仕营、刘朋、刘晓燕、李爱华、董济军、刘缵延、吴亚锋、马湘君、尹相菡、刘振华。5水生动物细菌性病原检测技术规范1 范围本标准规定了水生动物细菌性病原（Bacterial pathogens of aquatic animals）检测的试剂与材料、仪器设备、采样、细菌性病原分离培养和病原菌检测。本标准适用于山东省水生动物常见细菌性病原检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新
3、版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 4789.28食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求SC/T 70142006水生动物检疫实验技术规范SC/T 7201.1鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术SN/T 2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3 试剂与材料试剂与材料应符合GB 4789.28和附录A的规定。4 仪器设备按照SC/T 7201.1的规定执行。5 采样5.1 采样用具应使用无菌采样用具。5.2 采样数量、个体要求、采集部位按照SC/T 70142006中第6章的规定执行。5.3 样品运输及保存按照SN/T 2123的规定执行。6 细菌性病原
4、分离培养6.1 分离培养6.1.1 兼性厌氧菌和需氧菌的分离培养规范取样后，采用稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法等方式，在2830培养24h；低温下取样应在1518同步培养24h。6.1.2 厌氧菌的分离培养将处理好的平板置于玻璃干燥器，并在其上方放置连二亚硫酸钠和无水碳酸钠（分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内）各30g/1000mL容积，然后将干燥器盖严，用凡士林密封，在2830培养24h；低温下取样则应在1518同步培养24h。严格厌氧菌的分离培养应在厌氧工作台中进行。6.2 纯培养6.2.1 兼性厌氧菌和需氧菌的纯培养挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.1的方法培养。6.2
5、.2 厌氧菌的纯培养挑取单菌落，接种于相应培养基上，按照6.1.2的方法培养。6.3 多次纯培养若经过纯培养后，未能得到形态特征基本一致的单菌落，可进行多次纯培养，直到获得形态特征基本一致的单菌落，操作步骤应符合6.2的要求。7 病原菌检测7.1 病原菌16S rDNA序列分析7.1.1 菌落PCR按照附录B执行。7.1.2 结果判定7.1.2.1 PCR结果可靠DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照可见1472bp左右DNA条带，且阴性和空白对照样品无条带出现，则PCR实验结果可靠，可进行样品分析。7.1.2.2 电泳失败DNA Marker标准样品未出现条带，则电泳失败，
6、应检查电泳试剂重新进行电泳。7.1.2.3 检测结果无效DNA Marker标准样品出现清晰的梯度条带，阳性对照无条带或者DNA条带非1472bp左右，或者在阴性对照和空白对照样品中出现了DNA条带，则试验结果无效，应重新进行PCR扩增。7.1.3 克隆、测序和比对将7.1.2样品扩增条带克隆、测序，序列输入到NCBI网站进行比对，确定细菌的属种。7.2 病原菌生化特性检测按照SC/T 70142006中的9.4规定执行。7.3 结果综合判定需要鉴定病原菌到属依据7.1.3结果进行判定，需要进一步鉴定到种应结合7.2结果进行综合判定。AA附录A （规范性附录）试剂的配制A.1 TE缓冲液A.1
7、.1 A液：1mol/L TrisHCl(pH8.0)称取Tris碱6.06g，加去离子水40mL溶解，滴加浓HCl约2mL调pH至8.0，定容至50mL。A.1.2 B液：0.5mol/L EDTA(pH8.0)称取Na2EDTA2H2O 9.31g，加超纯水35mL，剧烈搅拌，用约1g NaOH颗粒调pH至8.0，定容至50mL（Na2EDTA2H2O需加入NaOH将pH调至接近8.0时才会溶解）。A.1.3 TE缓冲液量取A液5mL，B液1mL于烧杯中，加400mL去离子水混合，调pH至8.0，定容至500mL。A.2 1TAE缓冲液称取Tris 242.0g，Na2EDTA2H2O 3
8、7.2g于1L烧杯中，加800mL去离子水充分搅拌溶解，再加入57.1mL醋酸，充分混匀。最后以去离子水定容至1000mL即为50TAE缓冲液，使用时稀释50倍即可。BB附录B （规范性附录）菌落PCR测定B.1 制备DNA模板用无菌牙签挑取单个菌落到0.2mL PCR管中，加入10L无菌1TE（见附录A.1）缓冲液弹击混匀，标记，盖紧，100煮沸5min，-20冷冻5min（循环2次），5000r/min离心1min，取上清液检测DNA模板浓度，用于后续PCR扩增。当样本量少时也可采用合适的试剂盒制备DNA模板。B.2 PCR扩增采用50L PCR反应体系：DNA模板浓度范围为0.2ng/L
9、2ng/L，（用核酸测定仪测定DNA模板浓度，根据浓度值计算模板添加体积），10PCR Buffer（含Mg2+ 1.5mM）5L，dNTP（10mM）1L，上游引物（27F）：5AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3，下游引物（1492R）：5TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T 3（25M）各2L，Taq酶（2U/L）1L2L，去离子水补至50L，混匀，稍离心。反应管置于PCR仪中，首先95预变性5min；主循环30次：94 30s，50退火30s，72 30s（时间可根据片段长度调整）；终延伸72 10min，4保存。注： 不同细菌PCR程序可不同。B.3 电泳检测设置阳性样品对照（如大肠杆菌DNA）、阴性样品（如鱼的基因组DNA或细菌质粒DNA）对照、空白对照（无DNA）。1TAE（见附录A.2）缓冲液配置含核酸染料的2%琼脂糖凝胶，PCR扩增产物与6上样缓冲液混合，同时以DL2000或同等大小的DNA Marker标准样品为对照。10V/cm电泳30min，凝胶成像系统拍摄电泳结果。_
