《PCR、RT-PCR常见问题及分析(2020年整理).ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PCR、RT-PCR常见问题及分析(2020年整理).ppt（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、PCR常见问题分析及解决方案 重庆升博生物科技有限公司SHENGBOBIOTECHCO LTD PCR技术的发明 1983KaryMullis发明1985开始有文章发表1993获诺贝尔奖广泛用于分子生物学研究领域 pcr动画 exe PCR技术的基本原理 模板DNA的变性 93 95 左右 模板DNA与引物的退火 复性 Ta Tm 3 5 引物的延伸 TaqDNA聚合酶之5 3 DNA聚合酶活性 变性 退火 延伸三个步骤 PCR的基本原理 重复1 3步25 30轮 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 PCR标准反应体
2、系 DNA模板引物反应缓冲液Mg2 dNTP耐热聚合酶ddH2O 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板纯度蛋白 多糖 酚类等抑制PCR反应完整性模板降解会导致PCR扩增无产物浓度浓度适当 引物设计长度适当 避免二级结构和二聚体合成质量浓度50uL体系引物加量为10 20pmol 反应体系对PCR扩增的影响 反应BufferpH 盐离子 稳定剂 增强剂提供缓冲环境Mg2 浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTPMixture浓度适当 避免反复冻融ddH2OpH值适当 避免污染 反应BufferpH 盐离子 稳定剂 增强剂提供缓冲环境Mg2 浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTPMixtu
3、re浓度适当 避免反复冻融ddH2OpH值适当 避免污染 反应BufferpH 盐离子 稳定剂 增强剂提供缓冲环境Mg2 浓度过高非特异性严重过低无扩增产物dNTPMixture浓度适当 避免反复冻融ddH2OpH值适当 避免污染 如何选择最合适的DNA聚合酶 PCR用耐热DNA聚合酶 PCR实验的不同需求 4混合酶 1Taq酶 扩增效率最高 发现1969年 美国黄石国家公园温泉活性5 3 DNA聚合酶活性强5 3 DNA外切酶活性弱荧光探针 定量PCR方法 3 5 DNA外切酶活性无错配率每个循环约1 60003 末端加 A 能产物可直接进行 TA 克隆生产质检诱导大肠杆菌表达 三次柱纯化
4、分离获得94kD重组蛋白 无核酸酶和细菌DNA污染能有效扩增人基因组单拷贝基因室温放置一周 无明显活性改变 2pfu酶 保真度高 原理具3 5 核酸外切酶活性 即校正功能 效率相对较低3 末端不加 A 加A后才可进行TA克隆 用途表达基因的克隆基因的定点突变细胞内基因点突变分析 SNP 3HotStartTaq酶 特异性高 热启动Taq酶 原理蜡封抗体抑制化学修饰 提高PCR特异性 减少甚至避免非特异性扩增3 加 A 可直接做 TA 克隆用途混杂模板半定量 定量PCR 4混合酶 高扩增效率 高保真度 TaqplusTaq pfu用于复杂模板 GCrich 二级结构 扩增大多数情况下可替代Taq
5、 特别是产物在6Kb以上时 可扩10 20kb LongTaqTaq pfu超长片断扩增 15 40kb TaqplatinumHotStart pfu高扩增效率 高保真度 根据PCR实验的不同需求 基因组扩增 RT PCR 特异性基因突变 测序 表达克隆 保真性构建基因图谱 测序等 长片段扩增复杂模板扩增 GC含量高 二级结构 扩增效率 预配的PCR反应液DNA聚合酶反应缓冲液dNTPPCR增强剂 PCRMasterMix 特点 快速简便减少加样误差和污染灵敏度高可扩增低至2个拷贝的目的模板特异性强降低PCR反应的要求 增强特异性稳定性好 20 一年以上 反复冻融不影响活性 适用范围 大规模
6、基因检测目的基因拷贝数极低的样本GC含量高 有二级结构的模板复杂基因组样本 PCRMasterMix产品特点 PCR常见问题分析 PCR常见问题 无扩增产物非特异性扩增或拖尾假阳性 问题1 无扩增产物 现象 正对照有条带 而样品则无 M 样品A 样品B 正对照 纯度 含有抑制物浓度 含量低质量 全长结构 二级结构 原因 对策 纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板DNA加大模板的用量用好的反转录酶用温度高的反转录酶 无扩增产物之模板原因 引物错误引物设计不好引物降解引物合成 纯化不好 原因 对策 合成前检查评价 重新设计引物换一管新引物免费重新合成 无扩增产物之引物原因 退火温度延伸时间循环次数
7、原因 对策 递度PCR聚合酶的延伸速度适当增加循环数 无扩增产物之PCR条件原因 现象 条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 问题2 非特异性扩增 M12 非特异性扩增 开管轻柔 防止形成气溶胶 防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外更换试剂 耗材试剂分装 贮存适当 更换实验室和所有试剂耗材 问题3 假阳性 现象 空白对照出现目的扩增产物 对策 提高PCR特异性的策略 巢式PCR Nest PCR 递减PCR TouchDownPCR 热启动PCR HotStartPCR 使用PCR增强剂 四种策略 策略之一巢式PCR Nest PCR 增加有限量靶序列 如稀有mRNA 的灵敏度降低了扩增多
8、个靶位点的可能性提高困难PCR 如5 RACE 特异性 前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性 循环设在比估算的Tm高大约5 的退火温度下开始 然后每个循环降低1 2 直到退火温度低于Tm5 特异性最高的目的模板会被优先扩增 这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用 如AFLP DNA指纹分析等 策略之二递减PCR TouchDownPCR 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成 直到PCR仪达到变性温度通常选择热启动Taq酶热启动PCR是除了好的引物设计之外 提高PCR特异性最重要的方法之一 策略之三热启动PCR 甲酰胺
9、DMSO 甘油 甜菜碱等可能的机理 降低熔解温度 有助于引物退火 辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区增强剂浓度要适当 策略之四使用PCR增强剂 RT PCR简介 主要内容 RT PCR原理RT PCR步骤常见问题分析 两步法RT PCR mRNA 5 3 AAAAAAAA Poly A 尾 TTTT Oligo dT SuperRnaseH ReverseTranscriptase TTTT cDNA TTTT cDNA 3 5 5 3 PCR扩增 一步法RT PCR 两步法与一步法RT PCR比较 分析基因的转录水平获取目的基因合成cDNA探针 RT PCR主要用途 逆转录酶的选择 AMV
10、禽成髓细胞瘤病毒 逆转录酶和RNA酶H活性 最适42 最新版本可达60 Bioflux公司 MMLV Moloney鼠白血病病毒 逆转录酶 RNA酶H活性较弱 最适37 最新版本42 赛百盛 SuperRNaseH ReverseTranscriptaseMMLV反转录酶的RNaseH 突变体 它能将更大部分的RNA转换成cDNA 最适42 Tiangen天根生化 RNaseH的作用 水解RNA DNA杂合链中的RNASuperRNaseH ReverseTranscriptase MMLV反转录酶的RNaseH 突变体逆转录效率高 RT PCR引物的选择 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的
11、RNA 特异性最低 起始浓度范围为20 l体系50 250 g Oligo dT15 18 适用于具有PolyA尾巴的RNA 起始浓度范围为20 l体系0 2 0 5 g 特异性引物 与目的序列互补 是反义寡核苷酸 适用于目的序列已知的情况 起始浓度范围为20 l体系1pmol 提高RT PCR灵敏度 分离高质量RNA使用无RNaseH活性的逆转录酶 提高RT PCR特异性 提高逆转录酶保温温度减少基因组DNA污染 RT常见问题 RNA降解或起始量少RNA含抑制成分cDNA5 端不全目的基因在组织中不表达或表达量太低 原因 对策 分离高质量的RNA使用高温逆转录酶 如RT007 BioFlux
12、 使用随机引物或GSP尝试其它组织 问题1 RT PCR没有产物 六种Taq和MasterMix Taq Pfu HotStartTaq Taqplus LongTaq TaqPlatinumdNTP引物SP6 Tn7 M13 SuperRNaseH ReverseTranscriptase TA克隆系统 pBS T载体 连接和克隆试剂盒pGM T载体 连接和克隆试剂盒pCF T pCF Blunt载体 快速连接试剂盒感受态细胞 DNAMarker 22种不同大小的分子量标准 TIANGEN相关产品 PCR引物设计 引物的重要性 引物设计是PCR成功的关键 PCR引物设计大都通过计算机软件进行
13、 可以直接提交模板序列到特定网页 得到设计好的引物 也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件 引物设计需要一定的经验 不能单纯依赖软件 引物设计一般原则 长度 引物的长度一般为15 30bp 常用的是18 24bp 但长片段扩增时 引物长度30 35bp 引物过短易引起错配现象 例 一个12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点 而20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1 400个 较长的引物 28 35bp 还常用来区分同源性较高的模板序列或者用于产生一些突变位点 引物设计一般原则 结构 尽量避免引物序列形成发夹 特别是3 端 尽量避免引物间形成二聚体 特别是3 端前3个碱
14、基间不能有二聚体 避开局部富含GC或AT 3 端避开连续同样的碱基 如GGG CCC和ATrich 引物设计一般原则 错配 尽量避免引物在模板上有错配位点3 端尤其不要形成非特异性结合 无法避免错配时 最好不要有产物生成 引物3 端出现3个以上的连续碱基 如GGG或CCC 也会使错误引发机率增加 引物设计一般原则 GC含量 引物序列的GC含量一般为40 60 过高或过低都不利于引发反应 上下游引物的GC含量不能相差太大 不同的算法推荐45 55 或50 60 引物设计软件 PrimerPremier5 0 自动搜索 Oligo6 引物评价 VectorNTISuitDNAsisOmigaDNA
15、starPrimer3 在线服务 Primerpremier5 0使用简介 主要功能 1 引物设计2 限制性内切酶位点分析3 DNA基元 motif 查找4 同源性分析 Primerpremier5 0使用简介 引物设计最常用软件引物序列自动搜索功能最强大简单易用可用于设计简并引物 Primerpremier5 0使用简介 PrimerPremier5 0下载 安装 主页之下载中心PrimerPremier5 0使用演示 Primerpremier5 0使用简介 PrimerPremier5 0使用步聚 粘贴序列 复制序列 File New DNASequence Ctrl V 选ASisPr
16、imer Serch 设置引物参数 OK搜索完成再点OK 选择合要求的引物序列 Blast检查引物特异性 必要时重新设计 Primerpremier5 0使用简介 PrimerPremier5 0评价引物方法粘贴序列 复制序列 File New DNASequence Ctrl V 选ASisPrimer S EditPrimer Ctrl V Analyze Primer OKPrimer A EditPrimer Ctrl V Analyze Primer OK 免费引物设计服务 升博提供免费引物设计服务免费引物设计服务注意事项客户提供明确的序列客户明确引物设计要求设计报告以PDF文件提供 打开密码为升博网址 确认合成请再发序列至升博邮箱 sbio1999 PrimerPremier使用实例 Humanactin betaPrimer设计演示 致谢 Thankyouforyourattention 谢谢你的关注
