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1、ICS67.120.10B 40DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX猪肉中阿托品残留量的测定液相色谱-串联质谱法Determination of atropine residue in pork by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口
2、。本标准起草单位：山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、五莲县畜牧兽医管理服务中心。本标准主要起草人：李霞、邓立刚、李增梅、徐宁、陈璐、马新凤。5猪肉中阿托品残留量的测定液相色谱-串联质谱法1 范围本标准规定了猪肉中阿托品残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于鲜冻猪肉中阿托品残留量的测定。本标准方法检出限为2 g/kg，定量限为5 g/kg。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 原理试样中的
3、阿托品经磷酸二氢钾缓冲溶液提取，混合阳离子固相萃取柱净化（PCX净化柱），液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。4 试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水符合GB/T 6682一级水的规定。4.1 甲醇：色谱纯。4.2 甲酸：色谱纯。4.3 乙腈：色谱纯。4.4 正己烷：色谱纯。4.5 盐酸溶液（6 mol/L）：量取50 mL浓盐酸，用水稀释，转移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度线，摇匀。4.6 磷酸二氢钾缓冲溶液（0.1 mol/L）：称取磷酸二氢钾13.6 g，加900 mL水溶解，用盐酸溶液（4.5）调pH至4.0，转移至1 000 mL容量瓶中并定容至刻度线，摇匀。4.7
4、2 %氨化甲醇溶液：取2 mL氨水至100 mL容量瓶，用甲醇定容，摇匀。4.8 阿托品（分子式CAS：51-55-8）：纯度98 %。4.9 阿托品标准储备液：准确称取阿托品标准品0.01 g（准确至0.000 01 g），用乙腈溶解并定容至100 mL，摇匀，配制成质量浓度为100 mg/L标准储备液，避光-18 保存，有效期1年。4.10 阿托品标准中间液：准确移取5 mL阿托品标准储备液于50 mL容量瓶中，用乙腈定容，此时浓度为10 mg/L的标准中间液，避光-18 保存，有效期6个月。4.11 固相萃取柱：混合阳离子交换固相萃取柱（PCX，150 mg/6 mL，或性能相当者）。4
5、.12 微孔滤膜：有机相，0.22 m。5 仪器设备5.1 液相色谱三重四级杆串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI源）。5.2 分析天平：感量0.01 g和0.000 01 g。5.3 高速匀浆机：转速不低于10 000 r/min。5.4 高速冷冻离心机：转速不低于10 000 r/min。5.5 pH计。5.6 涡旋振荡器。5.7 氮吹仪。5.8 固相萃取装置。5.9 组织搅碎机。5.10 超声清洗机。6 样品取适量新鲜或冷藏的猪肉样品，充分搅碎均匀，-18 以下保存。7 测定步骤7.1 提取称取平行试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入磷酸二氢钾缓冲溶液（4.6）20
6、mL，加盖后涡旋摇匀，超声处理15 min；4 10 000 r/min离心5 min，转移上清液到50 mL离心管中。残渣中再次加入20 mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液，过滤，收集全部滤液于50 mL容量瓶中，用缓冲溶液定容至50 mL，待净化。7.2 净化依次用6 mL甲醇、6 mL水和6 mL 0.1 %甲酸水溶液活化PCX固相萃取柱，准确移取5 mL提取液以小于1 mL/min的流速过固相萃取柱，再依次用6 mL 0.1 %甲酸水溶液、6 mL甲醇、6 mL正己烷淋洗，弃去淋洗液，抽干，最后用5 mL 2 %氨化甲醇（4.7）洗脱，收集洗脱液，40 水浴氮吹至近干，准确加入1
7、mL 0.1 %甲酸水溶液复溶，混匀，过滤膜，用于测定。7.3 测定7.3.1 仪器参考条件液相色谱参考条件如下：a) 色谱柱：C18色谱柱，柱长100 mm，柱内径2.1 mm，颗粒内径1.7 m，或性能相当者；b) 流动相：0.1 %甲酸水溶液（A相），甲醇（B相）；c) 流速：0.3 mL/min；d) 柱温：40 ；e) 进样体积：2.0 L；f) 流动相梯度洗脱条件见表1。表1 流动相梯度洗脱程序时间min流动相A%流动相B%0.090100.590101.010903.010903.190105.09010质谱参考条件如下：a) 离子源：电喷雾离子源( ESI+）；b) 毛细管电压
8、：3 KV；c) 离子源温度：130 ；d) 脱溶剂气温度：500 ；e) 扫描方式：正离子；f) 监测方式：多反应监测（MRM），监测条件见表2。表2 多反应监测（MRM）条件化合物定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压eV碰撞能量eV阿托品290.2124.1290.2124.11022290.293.110307.3.2 标准曲线的绘制精确吸取一定量的标准中间溶液（4.10），逐级用乙腈稀释成质量浓度为1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的标准工作溶液。空白基质溶液氮气吹至近干，加入1 mL上述标准工作
9、溶液复溶，过微孔滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。以阿托品定量离子峰面积为纵坐标，以阿托品基质标准溶液质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。7.3.3 定性及定量7.3.3.1 定性测定通过试样色谱图的特征离子与相应对照溶液各色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对误差不大于2.5 %；试样特征离子的相对离子丰度与标准品特征离子的相对离子丰度一致，相对离子丰度偏差不超过表3 的规定，则可判断试样中含有阿托品。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差相对离子丰度50 %20 %50 %（含）10 %20 %（含）10 %允许的相对偏差202530507.3.3.2 定量外标法定量。7.
10、4 试样溶液的测定将基质标准工作溶液和试样溶液依次注入液相色谱质谱联用仪中，保留时间和定性离子定性，测定定量离子峰面积，待测样液中阿托品的响应值应在仪器检测的定量测定线性范围之内，超过线性范围时应根据测定浓度进行适当倍数稀释后再进行分析。7.5 空白试验除不加试料外，按照7.17.4规定进行平行操作。8 试验数据处理试料中被测阿托品残留量以质量分数计，单位以微克每千克（g/kg）表示，按公式（1）计算：(1)式中：被试样中阿托品残留量，单位为微克每千克（g/kg）；从基质混合标准曲线上得到的样液中阿托品的质量浓度，单位为微克每升（g/L）；V1 试样提取液体积，单位为毫升（mL）；V2 用于净化的上清液体积（mL）；V3 氮吹后样品复溶体积（mL）；m 试样质量，单位为克（g）；计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。9 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算数平均值的15 %。 AA附录A （资料性附录）阿托品特征离子质量色谱图阿托品特征离子质量色谱图见图1。图A.1 阿托品的特征离子质量色谱图（标准品浓度为10 ng/mL）_
