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1、核酸的分离与纯化 背景 核酸是遗传信息的载体 是最重要的生物信息分子 是分子生物学研究的主要对象 因此核酸提取也成为了分子生物学实验技术中的最重要 最基本的操作 核酸提取亦是临床分子诊断最关键的操作 直接关系到实验的成败与否 是临床分子诊断容易发生问题步骤 核酸的存在形式 DNA 细胞核DNP线粒体环状DNARNA 细胞质中 mRNA rRNA tRNA通常与蛋白质结合 形成RNP 核酸的理化性质 DNA RNA和核苷酸都是极性化合物 一般都溶于水 不溶于乙醇 氯仿等有机溶剂 它们的钠盐比游离酸易溶于水 RNA钠盐在水中溶解度可达40g L DNA在水中为10g L 呈黏性胶体溶液 在酸性溶液
2、中 DNA RNA易水解 在中性或弱碱性溶液中较稳定 DNP在低浓度盐溶液中 几乎不溶解 如在0 14mol L的氯化钠溶解度最低 仅为在水中溶解度的1 随着盐浓度的增加溶解度也增加 至1mol L氯化钠中的溶解度很大 比纯水高2倍 RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小 在0 14mol L氯化钠中溶解度较大 核酸提取方法 核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质 多糖 脂肪等生物大分子物质分开 核酸提取时应遵循以下原则 1 保证核酸分子一级结构的完整性 2 排除其他分子污染 核酸提取方法 大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括 细胞裂解 酶处理 核酸与其他生物大分子物质分离 核酸纯化每一步骤又可
3、由多种不同的方法单独或联合实现 核酸提取方法 细胞裂解 细胞裂解可通过以下几种方法实现 物理作用化学作用酶作用 生物作用 核酸提取方法 细胞裂解 物理作用 包括低渗裂解 超声裂解 微波裂解 冻融裂解和颗粒破碎等方法 这些方法用机械力使细胞破碎 但机械力也可引起核酸链的断裂 因而不适用于高分子量长链核酸的分离 超声裂解法提取的核酸片段长度从20kb之间 而颗粒匀浆法提取的核酸一般 10kb 核酸提取方法 细胞裂解 化学作用 变性 加热 加入表面活性剂 SDS TritonX 100 Tween 20 NP 40 CTAB sar cosyl Chelex 100等 或强离子剂 异硫氰酸胍 盐酸胍
4、 肌酸胍 碱性pH环境 强碱 NaOH 或碱性缓冲液 TE STE等 在一定的pH环境下 表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解 蛋白质和多糖沉淀 核酸释放到水相 某些缓冲液中的一些金属离子螯合剂 EDTA等 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2 Ca2 从而抑制核酸酶的活性 保护核酸不被降解 核酸提取方法 细胞裂解 酶作用 生物作用 主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶 蛋白酶K 植物蛋白酶或链酶蛋白酶 以使细胞破裂 核酸释放 蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质 促进核酸的分离 其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N 乙酰葡糖胺和N 乙酰胞壁酸残基间的 1 4 键水解 蛋白酶K能催化水解多种多肽键 其在
5、65 及有EDTA 尿素 1 4mol L 和去污剂 0 5 SDS或1 TritonX 100 存在时仍保留酶活性 这有利于提高对高分子量核酸的提取效率 核酸提取方法 酶处理 在核酸提取过程中 可通过加入适当的酶使不需要的物质降解 以利于核酸的分离与纯化 如在裂解液中加入蛋白酶 蛋白酶K或链酶蛋白酶 可以降解蛋白质 灭活核酸酶 DNase和RNase 或者加入DNase或RNase去除不需要的DNA或RNA 核酸提取方法 分离与纯化 酚氯仿法简介 1976 Stafford及其同事创立 现已经不断改进 关键技术 酚的使用用酚来分离核酸首先是Kirty 1956年首次报道 当时发现酚可以从水相
6、中抽提蛋白质 使用阴离子盐时 可以实现核酸分配在水相 而蛋白质在有机相 核酸提取方法 分离与纯化 酚氯仿法 核酸提取方法 分离与纯化 酚氯仿法酚的准备重蒸酚 去除可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联的醌类氧化物 加入8一羟基喹咛 以防止酚氧化 酚氧化发黄 而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联 水饱和酚 平衡PH 大于7 8 不饱和的酚能与15 其提及的水互溶 从而降低水相中核酸产量 发展和改进 SDS取代阴离子盐酚 氯仿混合液 增加了对糖 脂的溶解 异戊醇的使用 减少泡沫 使RNase失活 核酸提取方法 分离与纯化 酚氯仿法裂解缓冲液 异硫氰酸胍 处理蛋白酶K消化
7、根据需要亦可加入Dnase或RNAase 50 48 2苯酚 氯仿 异戊醇混合液 与等量的裂解处理液混合 依据应用目的 两相经漩涡振荡混匀 适用于分离小分子量核酸 或简单颠倒混匀 适用于分离高分子量核酸 后离心分离 疏水性的蛋白质被分配至有机相 核酸则被留于上层水相 转移水相 重复步骤3 直至满意为止 核酸沉淀 在含核酸的水相中加入pH5 0 5 5 终浓度为0 3M的NaAc或KAc后 钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷 在酸性环境中促进核酸的疏水复性 然后加入2 3倍体积的预冷的无水乙醇 经一定时间的孵育 可使核酸有效地沉淀 14000g离心30分钟 室温 或者如果产量较大可直接用玻璃钩子
8、取出 70 乙醇洗涤2 3次 即可将沉淀溶于TE保存 核酸提取方法 分离与纯化 酚氯仿法纯度高 RNA回收效率极高 尤其是 200bp的RNA 比如 siRNA miRNA mRNA和tRNA等除核酸外 可提取蛋白质耗时 繁琐 不利于自动化 正式名称 异硫氰酸胍 酚 氯仿核酸提取法ByPiotrChomczynskiandNicolettaSacchi1987 核酸提取方法 分离与纯化 盐析法 miller1 细胞裂解同前述 2 加入2体积的6mol L的NaCl 与3体积的细胞裂解液混合 震荡混匀 2500rmp离心15 20min 此时DNP溶解于上清中 蛋白质 RNA等位于离心管底部 3
9、 小心转移上清 同前步骤用乙醇沉淀法进一步纯化 核酸提取方法 分离与纯化 盐析法 NaAC1 细胞裂解同前述 并加入蛋白酶K消化2 加入1 10体积的3mol L的NaAC 与1体积的细胞裂解液混合 震荡混匀 20 孵育 15min 台式离心机最大速度离心15 20min 3 小心转移上清 同前步骤用乙醇沉淀法进一步纯化 核酸提取方法 分离与纯化 盐析法产量较低 但方法简单 比较酚氯仿方法无化学危害 同样不适合大规模自动化提取 提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高 核酸提取方法 分离与纯化 硅胶吸附法1 细胞裂解和酶处理同前述 2 处理好的裂解液转入硅胶离心柱 高速离心 利用硅胶可以吸附核酸而
10、不能与其它物质如蛋白质 脂类等结合的特点 洗脱这类杂质 3 重复洗涤 提高纯度 最后用核酸洗脱液获得核酸 裂解液 洗涤液 洗脱液装入位置 硅胶层 液体流出管道 核酸提取方法 分离与纯化 硅胶吸附法产量较低 纯度很好 也能造成大片段核酸的损伤 对极小片段核酸提取不够好 简单方便 可进行自动化处理 核酸提取方法 分离与纯化 磁性硅胶吸附法1 细胞裂解和酶处理同前述 2 处理好的裂解液与磁性硅胶颗粒混匀 孵育约30分钟 使裂解液中的核酸物质与硅胶粘附 3 利用磁力架固定吸附了核酸的硅胶颗粒 吸尽管中的液体 加入洗涤液重复本次步骤2次 4 洗脱液收获核酸 核酸提取方法 分离与纯化 磁性硅胶吸附法产量较
11、好 纯度很好 成本较低 无特殊耗材 可通过设计特异探针附着于硅胶颗粒 从而可捕获特异物种的核酸成分 可实现自动化作业 核酸提取方法 分离与纯化 加热煮沸法1 高速离心富集含核酸物质 2 加入促细胞裂解的化学物质 SDS TritonX 100 Tween20 NP 40 CTAB sar cosyl Chelex 100 等 加入蛋白酶K消化一段时间 也可不加 直接95 以上加热10分钟左右 3 高速离心 上清中的DNA即可用于PCR扩增 核酸提取方法 分离与纯化 加热煮沸法只能用于DNA提取 一般仅用于血清或体液中病原体DNA的提取 成本最低 临床应用最广 纯度低 产量低 除了PCR外不能直
12、接用于其它分子生物学操作 纯手工操作 临床PCR工作中最易出问题的环节 核酸提取方法 分离与纯化 RNA提取应该注意的问题 无处不在的RNase 比较耐高温 不易失活 解决的办法 1 用于分离RNA的耗材 如有可能必须采用高压灭菌 2 用于分离RNA的试剂尽量采用DEPC水配制 DEPC是RNase的强烈抑制剂 3 操作人员务必佩戴一次性乳胶手套操作RNA的提取 4 RNA提取体系中两种著名的RNA酶抑制剂 异硫氰酸弧 GTC 和 巯基乙醇5 低温离心 核酸提取方法 分离与纯化 其它核酸分离纯化的方法 1 玻棒缠绕法 玻璃粉 珠 吸附法 2 甲酰胺解聚法 3 离子交换层析 亲和层析法 4 密度梯度离心法 5 等等 核酸提取方法 分离与纯化 分离纯化方法小结
