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1、微生物学实验 实验一 培养基的制备和灭菌 一 目的要求 学习和掌握各种培养基的制备方法 其中包括培养基的配制 包扎及灭菌技术 二 基本原理 培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质 用人工方法配制而成的营养基质 其中含有碳源 氮源 无机盐 生长因子以及水分等 微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大生命力 因此不同种类的微生物应将培养基调到一定pH值范围 培养基种类很多 不同的微生物所需培养基不同 按其组成可分合成培养基和天然培养基 按其物理状态可分固体培养基 液体培养基和半固体培养基 按其特殊用途可分加富培养基 选择培养基 鉴别培养基 培养基配制后还必须进行灭菌
2、 灭菌和消毒是二个不同含义的名词 消毒是指消灭病原菌或有害微生物 而灭菌则是杀死或消灭一定环境中的所有微生物 消毒与灭菌的方法很多 但总的可分为物理法与化学法两大类 物理法包括加热灭菌 干热灭菌与湿热灭菌 过滤灭菌 紫外线灭菌等 化学方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其它物体表面进行灭菌与消毒 三 实验材料 每组同学需要准备以下材料 2人 组 小试管 12支 15 150mm 培养皿 12套 9cm 吸管 3支 1ml 三角玻扒 2支烧杯 1套 50ml 100ml 250ml 500ml 量筒 1个 100ml 玻棒 1支分液漏斗 1套药匙 2把剪刀 1把铁丝 数支标签贴纸 1
3、张铅笔 1支10ML玻璃吸管 1支 四 实验内容 一 培养基的配制 同学们先将试管贴好标签 注明培养基名称 组别 日期 标签粘贴位置在离管口1 3管身处 注意 标签用铅笔书写 以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹 操作图示 3 注意事项 本实验使用调配好的 干燥培养基 这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法 真空干燥法 低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉 或将培养基内的各种固形成分 经适当处理 充分混匀 便成干燥粉末而成 使用时只要按比例加入一定量的水 经溶解 无需调pH 分装 高压蒸汽灭菌 即可使用 干燥培养基 成品很容易吸潮 在称量时动作要迅速 另外 称药品时严防药品混杂 一把
4、药匙用于一种药品 或称取一种药品后 洗净 擦干 再取另一种药品 瓶盖也不要盖错 在烧杯融化琼脂的过程中 人要在电炉旁看着 以免培养基因沸腾而溢出烧杯 同时 需不断搅拌 以防琼脂糊底烧焦 注意带上棉纱手套防止烫伤 分装过程中 注意不要使培养基沾在管口上 以免沾污棉塞而引起污染 四 实验内容 二 培养基灭菌培养基分装好后 塞上棉塞 外面再包一牛皮纸 便可灭菌 灭菌的时间和温度按各培养基规定进行 以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分 培养基经灭菌后 可放在37恒温箱培养24小时 无菌者方可使用 在实验室里用得最多的加热灭菌法是高压蒸汽灭菌和干热灭菌 一般培养基和灭菌水等用高压蒸汽灭菌 而玻璃器皿常
5、用干热灭菌 蒸汽灭菌为105 121 15 20分钟 干热灭菌为160 170 1 2小时 目的都是使细菌体内蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的 在同一温度下 湿热杀菌效力比干热大 因为在湿热情况下 菌体吸收水分 使蛋白质易于凝固 同时湿热穿透力强 而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成水分时 又可放出热量 使温度迅速增高 从而增加灭菌效力 四 实验内容 三 包扎1 培养皿 以旧报纸密密包紧 一般以6套做一包 待灭菌 2 吸管 在距其粗头顶端约0 5cm处 塞一小段1 5cm长的棉花 棉花要塞得松紧恰当 过紧 吹吸液体太费劲 过松 吹气时棉花会下滑 然后分别将每支吸管尖端斜放在旧报纸条的的近左端 与报纸约
6、呈60 角 并将右端多余的报纸打一小结 3 三角玻扒 跟包扎吸管相似 将三角部分斜放在报纸条的近左端 与报纸约呈45 角 并将右端多余的报纸打一小结 四 实验内容 五 实验报告 思考题 培养基应具备哪些条件 在培养基配制操作过程中应注意什么问题 为什么 培养基配好后 为什么必须立即灭菌 如何检查灭菌后的培养基是无菌的 高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压 高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌锅内的冷空气排尽 灭菌完毕后什么情况下才可以开锅盖取出灭菌物品 玻璃器皿为什么在灭菌前要先行干燥 对含糖 如含葡萄糖或乳糖等 培养基进行高压蒸汽灭菌时 应采用多大压力 多长时间灭菌为宜 加热蒸汽灭菌为什么比干热
7、灭菌所要求的温度低 时间短 干热灭菌完毕后 在什么情况下才可开箱取物 为什么 实验二 微生物的接种 一 目的要求 训练微生物接种的基本技能基本建立无菌操作的概念 二 基本原理 接种技术是微生物学实验及研究中的一项最基本的操作技术 接种是将纯种微生物在无菌操作条件下移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中 为了获得微生物的纯种培养 指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂 繁殖而产生的后代 要求接种过程中必须严格进行无菌操作 一般是在无菌室内 超净工作台火焰旁或实验室火焰旁进行 根据不同的实验目的及培养方式可以采用不同的接种工具和接种方法 常用的工具有接种环 接种针 接种
8、铲 玻璃涂棒 移液管及滴管等 常用的方法有斜面接种 液体接种 穿刺接种和平板接种 这些方法在后面的实验一一进行训练 三 实验材料 1 各组所需的物品接种用具 接种环 针 钩 酒精灯 镊子 消毒棉球 打火机 标签贴纸 废物杯 一次性口罩 纸巾 准备移植的菌种 参考下列接种菌名 由老师提供 斜面培养基 肉汤培养基 6支 麦芽汁培养基 6支 为下次实验制备培养基的工具 参考实验一2 注意事项 酒精不足的酒精灯请自行添加 注意 添加量不得超过容量的2 3 将所有空白斜面贴好标签 注明接入菌种的名称 接种班别 接种组别 接种日期 接种前请将台面用抹布清洁 擦干 双手用洗手液清洁 擦干 斜面接种 分清菌台
9、和培养基 挑取少量菌种 切勿划破培养基 接种时要关闭门窗 风扇 人不要随意走动 端坐 平缓呼吸 不同的菌种 不同的接种方式 使用不同的接种工具 针 钩 环 吸管 四 实验内容 1 微生物的斜面接种技术 从已长好微生物的菌种管中挑取少许菌苔接种至空白斜面培养基上的过程 斜面接种的操作方法 1 操作前 先用75 酒精擦手 作表面消毒 待酒精挥发后才能点燃酒精灯 可通常是点燃酒精灯再用酒精擦手 2 用斜面接种时 将菌种管和斜面管握在左手的大拇指和其他四指之间 使斜面和有菌种的一面向上 并处在水平位置 3 先将菌种管和斜面管的试管塞旋转一下 以便接种时便于拔出 4 右手拿接种环 拿的方式与普通日常拿笔
10、一样 将要伸入试管部分的金属柄和金属丝在酒精灯火焰上灼烧灭菌 5 用右手小指 无名指或手掌将菌种管和斜面管的试管塞同时拔出 并把塞子握住 不得任意放在桌上或与其他物品接触 再以火焰烧管口 转下页 6 将上述在火焰上灭菌过的接种环伸入菌种管内 使接种环在接种菌种前先在试管内壁上或空白培养基接触一下 使接种环充分冷却 以免烫死菌种然后用接种环在菌落上轻轻地接触 刮取少许后将接种环自菌种管内抽出 抽出时勿与管壁相碰 也勿使再通过火焰 7 迅速将沾有菌种的接种环伸入斜面培管中 在斜面上 自下而上划线 使菌种沾附在培养基上 划线时勿用力 否则会使培养基表面划破 8 接种完毕后将接种环抽出 灼烧管口 塞上
11、试管塞 塞试管塞时勿要用试管口去迎试管塞 以免试管在移动时侵入杂菌 9 接种环在放回原位前 要经火焰灼烧灭菌 同时须将试管塞进一步塞紧以免脱落 接种菌名及接种划线方式 接种工具 细菌 枯草杆菌 大肠杆菌 单球菌 谷氨酸菌 假单孢杆菌 巨大芽孢杆菌 6支 接种方式 之 字划线 接种工具 接种环 霉菌 黑曲霉 黄曲霉 根霉 3支 接种方式 点植或划直线 接种工具 接种钩或接种环 酵母菌 面包酵母菌 古巴酵母菌 假丝酵母菌 3支 接种方式 划直线 接种工具 接种环 图4 11各种无菌操作接种技术示意图 图4 11各种无菌操作接种技术示意图 图2 1各种无菌操作接种技术示意图 图2 2穿刺接种操作过程
12、示意图 将接种好的斜面试管置最适合该菌种生长的恒温培养箱里 一般细菌于37 恒温培养箱培养1 2d一般霉菌和酵母菌于32 恒温培养箱培养2 3d 2 生物的培养技术 培养箱恒温培养法 3 为下次实验准备平板培养基 各组同学先三角瓶贴好标签 注明培养基名称 组别 日期 标签粘贴位置在离瓶口1 3瓶身处 注意 标签用铅笔书写 以防高温灭菌时蒸汽模糊字迹 培养基配方 肉汤培养基 营养肉汁2g自来水100mLPH7 2麦芽汁培养基 麦芽汁10g自来水100mL自然PH固体培养基 由液体培养基加2 琼脂 1 配制肉汤平板培养基100mL将小烧杯置天平上 用药匙取营养肉汤干燥培养基 称取2g加少量自来水
13、溶解彻底转移到量筒 定容至100mL 再装入250mL三角瓶 加入琼脂2g 浸泡于液体培养基里 用棉塞塞好瓶口 再用防潮纸和棉绳将棉塞罩住扎好 2 配制麦芽汁平板培养基 方法同上 配制好的培养基进行灭菌 五 实验报告 1 观察记录实验结果 微生物琼脂斜面上的生长状况 2 思考题 接种环 针 接种前后灼烧的目的是什么 为什么在接种前一定要将其冷却 如何判断灼烧过的接种环已冷却 培养不同种类微生物能否用同一种培养基 为什么 细菌 酵母菌 霉菌通常用什么培养基培养 实验三 微生物的分离纯化技术 一 目的要求 学习从混杂的微生物群体中分离与纯化微生物菌种的方法 综合练习微生物学实验的各种无菌操作技术
14、二 基本原理 自然界中各种微生物混杂生活在一起 即使取很少量的样品也是许多微生物共存的群体 人们要研究某种微生物的特性 首先须使该微生物处于纯培养状态 微生物的分离 纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程 微生物的平板分离纯化技术自1880年被发明以来以有100多年的历史 该技术的建立和发展为人类获得丰富的微生物资源以及在工 农 医 环境 动物细胞培养等方面的应用作出了巨大的贡献 平板稀释涂布 平板稀释混合 平板划线法是分离和纯化微生物的常规方法 分离纯化技术其实是进行平板接种 即用接种环将菌种接至平板培养基上 或用移液管 滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上 然
15、后培养 平板接种的目的是观察菌落形态 分离纯化菌种 活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法 本实验是利用分离纯化技术来获得三大类微生物的平板纯培养物 为下次实验微生物的形态观察提供菌落形态的部分 形态观察主要包括群体形态 菌落形态 和个体形态观察两个方面 三 实验材料 1 各组所需物品 无菌培养皿 两包 12套无菌三角玻扒 1支无菌吸管 3支接种器具 酒精灯 镊子 消毒棉球 打火机 标签贴纸 圆珠笔 一次性口罩 纸巾 制平板的培养基 肉汤琼脂培养基 1瓶 麦芽汁琼脂培养基 1瓶 于杀菌锅里保温 2 平板的制备 将融化的琼脂培养基 冷却至50 左右 以手背能忍受的温度为准 温度过高时
16、 皿盖上的冷凝水太多 温度低于45 时 培养基易于凝固而无法制作平板 平板的制作应在酒精灯火焰旁进行 右手掌心握住三角瓶的底部 左手打开三角瓶棉塞 以右手的无名指和末指夹持瓶塞 灼烧瓶口 左手拿培养皿 用左手的大拇子将皿盖掀开一缝 至瓶口刚好伸入 向皿内注入培养基 约15mL 厚度约0 5mL左右 迅速盖好皿盖 左手持培养皿稍加旋转摇动 使培养基均匀分布于整个培养皿底部 然后平置于桌面水平位置 待凝后即为平板 四 实验内容 1 平板混合分离法 大肠杆菌 枯草杆菌 单球菌 3皿 将菌液分离样品摇匀 用无菌移液管取1ml的菌液移至无菌培养皿中 然后将融化 凉至50 左右的培养基 在每个培养皿内各倒入约15ml 摇匀 凝固 制成平板 图3 1混合倒平板操作法示意图 四 实验内容 2 平板划线分离法 3皿 将菌液分离样品摇匀 以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液 将菌液点种在平板边缘一处 取出接种环 烧去多余的菌种 将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙 约30 伸入平板 在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却 然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线 划线时平板面与接种环面成30 40
