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1、第7章RNA转录 7 1RNA转录概述 转录的选择性转录有特点起点和终点 即转录单位RNApol不对称转录启动子底物NTPs延伸方向5 3 7 1 1转录的一般特点 几个概念 1 转录不对称 用枯草杆菌中的SP8噬菌体为材料实验证明 2 模板链作为模板的DNA单链称模板链或反义链 antisensestrand DNA极性与RNA相反 3 非模板链非模板链称为有义链 sensestrand 或编码链 DNA极性与RNA相同 4 转录单位 transcriptionunit 又称转录子 指转录模板DNA链中从启动子到转录终止子的区段 可以是一个基因 基因簇 或操纵子 模板链 反义链 1 非模板链
2、 有义链 编码链 5 复合转录单位 所转录的RNA经剪接能形成几种成熟的mRNA 得到不同翻译产物的mRNA区段 或几种不同的RNA 如rRNA和tRNA来自同一条RNA前体 6 转录效率 转录单位时间内所合成的RNA分子中nt数目例 T7的转录效率为100 200nt 秒 原核生物平均20 25nt 秒 真核细胞45 100nt 秒 可见转录效率差异较大 7 转录起点定位转录起始由DNA分子上的启动子 Promoter P 控制 P一般靠近转录起点 即DNA实际转录RNA的第一个碱基 这个位点核苷酸编号 1 从转录起点沿聚合酶方向称下游 nt编号依次为 2 3 而相反方向为上游 nt编号依次
3、为 1 2 一般DNA的序列从左向右书写 用编码链的序列代表基因 因为它与RNA链序列相同 RNA聚合酶的差异转录产物的差异真核生物转录产物的加工原核生物转录产物mRNA为单顺反子 真核生物的mRNA大多是单顺反子 7 1 2原核和真核生物转录差异 启动子指DNA分子上被RNA聚合酶所识别并结合形成转录起始复合物的区域 是控制转录起始的序列 决定基因转录的起始位点和表达强度等 7 2 1原核生物启动子结构 7 2启动子的结构与功能 原核启动子的发现和证实 Footprinting 足迹 technique验证核心启动子 RNA聚合酶 没有NTP DNase 消化 分离 测序 原核生物基因核心启
4、动子 10区为Pribnowbox保守序列 T80A95T45A60A50T96功能 1 RNApol紧密结合位点 2 10区序列对于DNA解旋十分重要 3 使RNApol定向转录 35序列又称Sextamabox保守序列 T82T84G78A65C54A45功能 RNApol识别位点 35和 10序列间距离保持稳定 范围在15 20bp 是RNApol结构的要求 有利与酶的结合 17bp时转录效率最高 转录起始位点附近序列影响转录起始效率 强启动子和弱启动子 区别在于和启动子序列与标准启动子序列同源性程度的大小 上升突变与下降突变 如突变后序列偏离标准序列 启动子效率下降 为下降突变 反之突
5、变后启动子序列更接近标准序列 启动子效率增强 为上升突变 下将突变通常是A T碱基对突变为G C碱基对 使稳定性增强 也有A T变为T A 改变碱基堆积力 或改变RNA聚合酶的结合能力 原核生物启动子的突变效应 原核启动子的其他组成部分和功能 rrnBP1基因启动子结构 E coli细胞含有7个编码rRNA的基因 当快速生长需要大量rRNA时 这7个基因在细胞内自身可完成大量的转录 驱动这些基因转录的启动子显然很强大 原因是启动子上游元件在发挥作用 核心启动子上游 40 60处有一个UP元件 它能被RNApol 亚基CTD识别 仅在RNApol存在情况下就能将rrnBPl基因的转录效率提高30
6、倍 因此认为UP元件也是一个启动子元件 rrnBPl基因启动子还与 60与 150之间的3个Fis位点有关 是转录激活蛋白Fis的结合位点 这些位点本身不与RNA聚合酶结合 是非典型启动子元件 而属于增强子的转录激活DNA元件 E colirrn启动子也被一些小分子物质调节 即起始NTP iNTP 和预警子 alarmone ppGpp 大量iNTP的存在表明核苷酸的浓度很高 有利于合成大量的rRNA 相应的iNTP还能稳定开放启动子复合体促进转录 此外 当细胞发生氨基酸饥饿时 蛋白质合成受到抑制 对核糖体的需要量随之减少 核糖体是氨酰 tRNA的结合部位 当空载tRNA与核糖体结合后 由于核
7、糖体对氨基酸的缺乏十分敏感 与之相关的蛋白RelA接收 预警 催化合成 预警子 ppGpp 35区能增强启动子与聚合酶 因子的识别作用 10区序列对于DNA解旋十分重要起始点附近的序列影响转录起始效率 7 2 2原核生物启动子功能 7 3细菌的RNA聚合酶 7 3 1RNA聚合酶概述 RNA聚合酶系统为一种动态的功能性装置 其结构组成及催化活性在转录过程中始终处于变化之中RNA聚合酶的亚基 整个转录过程所必须的蛋白质组分转录因子和辅助因子 参与转录调控和起始 终止等所需的蛋白因子 7 3 2细菌的RNA聚合酶 10kD E coliRNApol含有 亚基为起始亚基 将a2 部分称为核心酶 RN
8、Apol全酶由6分子亚基组成 即 2 与酶复合体组装相关 识别并结合DNA链上的启动子能沿DNA链蠕动并解开DNA双螺旋 转录后使双螺旋恢复能同时与局部链分离的DNA及转录产物RNA链结合按DNA链的模板序列选择正确的底物 以正确方向合成识别转录终止信号能与转录因子相互作用以调节转录速度在转录阻遏情况下 能自身调整恢复和维持RNA合成 RNA聚合酶全酶的功能 实验证明 对抑制RNApol转录功能的抗生素研究 发现由rpoB基因编码的 亚基是催化中心 利福平是RNApol的强抑制剂 能与 亚基结合 阻止转录起始 但不影响延伸 这类抗生素不抑制真核RNApol 因此在医药上被用于治疗革兰氏阳性菌感
9、染和结核病 抗生素利迪链菌素能抑制转录延伸 能产生对该抗生素抗性的突变基因被定位在rpoB基因内 研究证据 亚基有两个结构域 分别负责转录的起始和延伸 亚基是个碱性蛋白 由rpoC基因编码 与DNA之间以静电引力结合 并能结合两个Zn2 Zn2 与RNApol的催化作用有关 具有多个阴离子的肝素能结合到 亚基上 体外实验发现 肝素能抑制转录作用是由于它能与DNA竞争性地结合聚合酶的催化中心 亚基负责酶与模板DNA的结合 RNApol与不同基因启动子的亲和力不一样 结合常数的变动范围在l06 1012 受亲和力的影响 起始频率也各不相同实验例证 rRNA基因启动子为1次 s 而lacI启动子为每
10、30min 次 细胞内 因子的数量只占核心酶的30 因此 大约只有1 3的RNApol是以全酶形式存在的 70是大肠杆菌细胞中最丰富的一类 因子 参与大肠杆菌大多数基因的转录 在不同细菌细胞中 的种类变化很大 从只有一种到60几种 生活方式多变的物种体内 的种类多 大肠杆菌利用不同的 适应环境的变化 和真核细胞中的基因特异转录因子的功能有些类似 因子的种类 7 3 3 因子 区段4识别 35element区段2识别 10element区段3识别 10element上游延伸段 因子不同区段结合启动子不同区域 亚基能识别并引导RNApol稳定结合到启动子上 能使核心酶对特异序列的亲和力加强 对非特
11、异序列的亲和力降低 全酶的核心酶不能区分DNA启动子和一般序列 核心酶与DNA的结合常数约为109 mol L 1 停留的半衰期约60min 但当 因子与核心酶结合后 与DNA一般序列的结合常数下降为105 半衰期小于1s 而与DNA启动子序列的结合常数达到1012 半衰期为数小时 二者的结合常数相差约107 即 因子减少全酶与非启动子序列的非特异性结合而增加与启动子序列的特异性结合 因子能促进RNA聚合酶与启动子的结合 因子使RNApolymerase与启动子紧密结合 缺乏 因子的核心酶对模板没有选择性 进行对称性转录 因子可以循环利用 只有一条多肽链不识别大肠杆菌的基因转录启动子 而只识别
12、转录起点在内的23bp的启动子结构高活性 不受调控 常用于原核细胞基因是体外表达系统 7 3 4T7RNA聚合酶 7 3 7原核生物RNA的转录过程 1 封闭复合物2 开放复合物3 启动子清空 起始 1 全酶与模板DNA接触 生成非专一不稳定的复合物在模板上移动 2 起始识别 全酶先与 35序列结合 产生封闭的酶 启动子二元复合物 3 之后全酶向下游滑动 紧密结合到 10序列 模板DNA局部变性 形成开放的启动子二元复合体 4 RNA聚合酶移动到起始位点 第一个NTP转录开始 形成酶 启动子 NTP三元复合体 5 酶在起始位点聚合9 10nt的转录物 形成酶 启动子 RNA三元复合体 流产性转
13、录物6 启动子清除 释放 因子 RNApol变构 驱动移出启动子区 启动子清除时间 从第一个磷酸二酯键形成到 因子脱离 RNApol开始向下游移动的时段 时间长短与启动子强弱有关 延伸 1 从起始到延伸 RNAP的构象发生很大的变化 2 RNAP占据转录泡约30bp大小的空间 3 RNAP催化位点具有底物结合位点和产物结合位点 4 转录方向 5 3 5 合成速率 40 50nt s 从转录起始到延伸的结构变化1 RNA的5 端脱离模板链2 RNAP释放 因子 与模板结合较为松弛 3 RNAP沿着模板以类似于蠕虫屈伸向前运动的方式 35nt收缩28nt突然前伸35nt转录泡 转录位点13个碱基对
14、的解链区域 一个动态 短暂的解链结构 转录过程需要拓扑异构酶 和 新生RNA链与模板链形成只有几个碱基的杂交双链 延伸阶段 elongationphaseRNA聚合酶在DNA链上伸展的大小和形状在转录过程中发生很大变化 有以下3种形式 当全酶最初结合于DNA时覆盖75 80bp 从DNA的 55伸展到 20 在起始阶段一直保持在这个位置上 从起始转入延伸 聚合酶形状伴随 因子释放而变化 无 因子时 酶离开DNA在 55 35区域 说明 启动子上游部分与DNA聚合酶初识别有关 但不参与起始后期过程 当RNA链伸长到15 20bp时 酶分子构象进一步转变 形成延伸复合物 覆盖30 40bpDNA
15、随着延伸反应的周期性进行 RNA聚合酶覆盖DNA的长度外形呈现蠕虫爬行时的周期性屈张变化 随着酶沿DNA链前移 解链区跟着前移 新生RNA链不断生长 并与模板链在解链区形成RNA DNA杂交体 其后DNA恢复螺旋结构 RNA链被置换出来 RNA聚合酶覆盖DNA的长度外形呈现蠕虫爬行时的周期性屈张变化 影响新生链延伸速度的因素 RNApol的来源如E coli的RNApol转录T7的速度为17nt s 而其它细菌的聚合酶为12 19nt s左右 模板链的特殊序列新生链延伸速度并非恒定 虽然RNApol对DNA模板上的4种碱基都等效渗入 但当遇到模板特殊序列时 转录速度会下降到 0 1nt s 这
16、种序列称为暂停信号 暂停状态的模板链大多富集G C或反向重复 后者能使产物形成茎环 阻止了RNA DNA杂合链的部分结构 影响聚合酶前移 预警子的干扰离体实验发现 ppGpp 预警子 影响转录延伸速度 但与底物NTP的渗入之间无竞争现象 说明底物NTP与ppGpp在酶分子上结合部位不同 大肠杆菌nusA蛋白也有调节延伸速度的功能 转录过程的终止 概念 种类 提供停止信号的DNA序列称终止子 terminator 两种类型 内在终止子 强终止子 依赖 因子的终止子 弱终止子 转录过程的终止 内源性终止子 Terminator 终止子 transcriptionstopsignal 不依赖Rho因子的终止子 内源性终止子 富含G C的反向重复序列 发夹结构 非模板链上富含4 6个连续或不连续的T序列 3 使转录泡结构不稳定 新生RNA链上成串的U序列与模板链形成了一串较弱的rU dA碱基对 约8bp 即RNA链的生长端只有一段寡聚U与模板上的寡聚A结合着 由于rU dA杂合链处于链生长的末端 此处的氢键和碱基堆积力较弱 很容易被解链而使转录暂停 进而导致转录终止 倒向重复 茎环结构 但是没
