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1、第四章抗体制药 第一节概述 1890年Behring和北里柴三郎发现白喉抗毒素 建立了血清疗法 开创了抗体制药之先河 1937年Tiselius用电泳法将血清蛋白分为白蛋白 球蛋白 并证明抗体活性主要存在于 球蛋白组分 球蛋白制剂是紧急预防甲型肝炎等传染病的有效药物 抗体 Antibody 是指能与相应抗原特异性结合具有免疫功能的球蛋白 抗体的产生 机体免疫系统受抗原刺激后 B淋巴细胞被活化 增殖和分化为浆细胞 由浆细胞合成和分泌的球蛋白 免疫球蛋白与抗体的关系20世纪60年代初期 发现多发性骨髓瘤是浆细胞癌变形成的恶性增殖性疾病 病人血清中出现同抗体结构类似的球蛋白 统称为免疫球蛋白 imm
2、unoglobulin Ig Ig是化学结构的概念 而抗体是生物学功能的概念 所有的抗体均是Ig 但并非所有Ig分子都具有抗体活性 多克隆抗体与单克隆抗体多克隆抗体 病原微生物含有多种抗原决定簇的抗原物质 因此产生的抗体制剂也是多种抗体的混合物 故称多克隆抗体 病原诊断时易出现假阳性 1975年K hler和Milstein首先利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体 monoclonalantibody McAb 单克隆抗体具有高度特异性 均一性 来源稳定 可大量生产等特点 为抗体制备和应用提供了全新的手段 还促进了基础和临床医学的发展 单克隆抗体定义 是将抗体产生的细胞与具有无限增殖能力的
3、骨髓瘤细胞相融合 通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体 单克隆抗体的应用 单克隆抗体作为抗体制剂 在临床上主要用于疾病的诊断和治疗 单克隆抗体检测与某些疾病有关的抗原 辅助临床诊断 用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像 做免疫定位诊断 单克隆抗体用于临床治疗 如针对于T淋巴细胞共有的分化抗原CD3 Clusterofdifferentiation CD3 的单克隆抗体作为因对器官移植免疫排斥有抑制作用 用作免疫抑制剂已经上市 以单克隆抗体作为药物的载体对肿瘤进行定向治疗 从1984年报道人 鼠嵌合抗体以来 已制备出改形抗体 单链抗体 单域抗体 最小识别单位等诸
4、多类型 基本上消除了鼠源性单克隆抗体的免疫原性 相对分子质量只有完整抗体分子的1 80 1 3 原来鼠源性单克隆抗体的诸多生物学活性已消失 如激活补体 促进吞噬功能 免疫调理 抗体依赖细胞介导的细胞毒副作用等 只保留同抗原特异性结合的活性 即仅应用其导向作用 制备导向药物用于肿瘤治疗 第二节单克隆抗体 是将抗体产生的细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合 通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体 单克隆抗体是针对一个抗原决定族的抗体 又是单一的B淋巴细胞克隆产生的 它的结构和特异性完全相同的高纯度抗体 一 抗原与动物免疫制备特定抗原的单克隆抗体 首先要制备用于免疫
5、的适当抗原 再用抗原进行动物免疫 有的抗原可以用化学合成 地高辛 但在多数情况下抗原物质只能得到部分纯化 如部分纯化的干扰素 在经过克隆化选出最适当的单克隆抗体 在制备恶性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时 情况更为复杂 需要整个肿瘤细胞作为免疫原 经过筛选 克隆化制备出仅存于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上的表面标志分子的单克隆抗体 为使杂交瘤细胞稳定 免疫的动物和骨髓瘤细胞供体是同一品系动物 常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB c小鼠和LOU大鼠 因此免疫动物也采用相应的品系 最常用的也是BALB c小鼠 免疫的方法采用体内免疫法和体外免疫法 体内免疫法适用于免疫原性强 抗原量较多时应用 一般用8
6、12周龄雌性鼠 颗粒性抗原 如细菌 细胞抗原 的免疫原性强 可不加佐剂 直接注入腹腔10 个细胞进行初次免疫 间隔1 3周 再追加免疫1 2次 可溶性抗原按每只小鼠10 100 g抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内 进行初次免疫 间隔2 4周 再用不加佐剂原抗原追加免疫1 2次 一般在采集脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原 目的是最大限度刺激B细胞分裂为浆细胞 合成大量的抗体 有人主张采用脾内免疫法 脾内免疫法即在麻醉下直接把0 1 0 2mL抗原注入脾脏进行免疫 细胞抗原需105个 可溶性抗原需10 g 节省抗原量 体外免疫法用于不能采用体内免疫的情况下 如制备人源性单克隆抗体 免疫源性
7、极弱 易引起免疫抑制 优点 需抗原量少 几个 g 免疫期短 d 干扰因素少 体外免疫法基本方法 用4 8周龄BALB c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液 再加入适当抗原使其浓度达0 5 5 g mL 在5 CO2 37 下培养4 5d 再分离脾细胞 与骨髓瘤细胞进行杂交 o 二 细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养细胞融合的基本方法 脾细胞 1 10 骨髓瘤细胞 2 10 混合聚乙二醇 PEG 诱导下融合 时间 2min 然后用培养液将融合液缓慢稀释 细胞融合的骨髓瘤细胞应具备的条件 应具有融合率高 自身不分泌抗体 所产生的杂交瘤细胞分泌抗体能力强且长期稳定 PEG的要求 PEG相对分子量4000 浓度
8、为50 二甲基亚砜 DMSO 增加融合率 细胞融合后 可产生多种融合 脾 脾 脾 瘤 瘤 瘤融合细胞和未融合的细胞 常用的选择性培养 HAT培养基 它是用次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 和胸腺嘧啶 T 配制的 A能阻断DNA合成的主要途径 杂交瘤细胞筛选 SP2 0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT 缺乏株 脾细胞内却有这种酶 因此脾 瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶 用次黄嘌呤 H 和胸腺嘧啶 T 合成DNA 使杂交瘤细胞得以生长 杂交瘤细胞选择性培养的常规方法是将融合的细胞悬浮于HAT的培养液中 加入到含有饲养细胞的96孔板内 根据情况每2 3天换液一次 换液时吸去1
9、 2 2 3培养液 加入等量的新鲜培养液 在融合后7天内用HAT培养液 杀死瘤 瘤融合细胞后 第7 14天改用HT培养液 14天以后用普通的RPMI1640完全培养液 从融合后8 9天就可对所有克隆生长孔的培养液上清进行抗体检测 筛选出产生抗体的阳性克隆 在最适的培养条件下 大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞 大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡 单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活 需要加入饲养细胞才能使其繁殖 常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞 脾细胞和胸腺细胞等 饲养细胞的作用 释放某些生长刺激因子 满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性 小鼠腹腔巨噬细胞能清除死亡细胞 故应用的较多 三 筛
10、选阳性克隆与克隆化筛选阳性克隆常用的检测方法 免疫酶技术 免疫荧光技术 放射免疫技术等 克隆化是指单个细胞通过无性繁殖而获得细胞集团的整个培养过程 ELISA用于破伤风毒素抗体的筛选 ELISA的种类 酶联免疫吸附测定法 Enzymelinkedimmunosorbentassay ELISA 直接ELISA 间接ELISA 双夹心ELISA 竞争ELISA 酶抗酶ELISA 双抗夹心ELISA DAS ELISA 单克隆捕获ELISA Mac ELISA 酶联板吸附抗原ELISA等 四 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 杂交瘤细胞鉴定 染色体分析 它不仅可作为鉴定的客观指标 还能了解分泌抗体的能力
11、 单克隆抗体进行Ig类 IgG IgM IgA IgD IgE 和亚类鉴定 可用羊或兔抗Ig不同类或亚类的抗体 进行免疫扩散或ELISA鉴定 特异性 亲和力 纯度 识别抗原的相对分子量等进行测定 五 单克隆抗体的大量制备 大量制备单克隆抗体的方法主要有两种 一种是体外培养法 可获得10 g mL的抗体 另一种是动物体内诱生法 可获得5 20mg mL的抗体 目前多采用后者生产制备单克隆抗体 动物体内诱生法大量制备单克隆抗体用BALB c小鼠降植烷腹腔杂交瘤细胞 0 5mL 1X106 取腹水离心上清 接种后7 12d抽取腹水 抽取几次可达10mL 六 单克隆抗体的纯化依单抗Ig类和亚类不同 用
12、途不同应选用不同的纯化方法 用于体外诊断试剂的话 IgG类抗体应采用沉淀处理结合亲和层析的方法 IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法 若制备体内诊断试剂或治疗用药则应注意去除内毒素 病毒 核酸等微量的污染物 必须经亲和层析和阴离于交换层析处理 动物体内诱生法制备的单克隆抗体具体纯化方法及一般过程 1 离心取上清 超滤 盐析 2 分离 纯化 凝胶过滤 用于IgG和IgM单抗的分离纯化 阴离子交换层析 IgG单抗纯化 蛋白A亲和层析 IgG单抗的纯化 第三节鼠源性单克隆抗体的改造 杂交瘤单抗为鼠源性 应用于人体产生人抗鼠抗体及毒副作用 需要对鼠源性的单抗进行基因加工和改造 使其发挥作用和增
13、加治疗效果 目的 降低免疫源性 降低相对分子质量 增加组织通透性 如 人 鼠嵌合抗体 改形抗体 小分子抗体等人源化单抗 抗体单拷贝或IgG结构图鼠抗体可变区中关键氨基酸的分布 一 人 鼠嵌合抗体 抗原抗体结合功能决定于抗体V区 同种性免疫原性则决定于抗体C区 在基因水平上将鼠源单抗的H和L链可变区基因分离出来 分别与人Ig的H和L链的C区基因连接成人 鼠嵌合抗体的H和L链基因 再转染骨髓瘤细胞 就能表达出完整的人 鼠嵌合抗体 它保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性 但对人的免疫原性大幅度下降了 二 改形抗体 CDR移植抗体 Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补决定区 C
14、DR区 而不是整个可变区 H和L链各有三个CDR 其它部分称框架区 用鼠源单抗的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列 则可使人的Ig分子具有鼠源单抗的抗原结合特异性 抗体分子中鼠源部分只占很小比例 可基本消除免疫原性 这种改形抗体又称CDR移植抗体 模板替换 表面重塑 补偿变换 定位保留 三 小分子抗体 基因工程小分子抗体仅表达鼠源单抗的V区片段 相对分子质量为原抗体的1 80 1 3 即保留CDR区 而Ig分子中的C区不表达 小分子抗体类型有 Fab抗体 FV抗体 单链抗体 VH VL 单域抗体 VHorVL 最小识别单位 单个CDR 单链抗体基因构建的一般方法 从杂交瘤细胞提取mRNA 反
15、转录成cDNA 通过PCR扩增抗体VH和VL基因 人工合成一条寡核苷酸序列 称Linker序列 将VL的C端与VH的N端或VH的C端与VL的N端相连接 构建成单链抗体基因 单链抗体的优点 可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白 肿瘤显象的背景更加清晰 易渗透肿瘤组织中 增加药物治疗浓度 免疫源性小 可消除人抗鼠的排异反应 延长在人体内的半衰期 单链抗体大多在大肠杆菌中表达 有三种形式 直接在细胞质中表达 与其它菌体融合表达融合蛋白 分泌表达具有功能的单链抗体 通过单链抗体的C末端连接另外单链抗体基因 构建和表达双特异单链抗体 可应用于肿瘤的诊断和治疗 它还可与IL 2 TNF等细胞因子基因连接 使
16、细胞因子能特异性杀伤肿瘤细胞 增强抗肿瘤活性 降低其毒副作用 四 双功能抗体 双功能抗体就是双特性抗体 它是一种非天然性抗体 其结合抗原的两个臂具有不同的特异性 构建方法 化学交联法 双功能试剂SPDP 生物学方法 杂种 杂交瘤 基因工程法 双功能抗体一个臂识别肿瘤细胞表面抗原 包括肿瘤相关抗原 癌基因产物 特殊的白细胞分化抗原 病毒蛋白抗原 特异性受体等 并实施有效的结合 而另一个臂可识别免疫效应细胞及分子 如CD3 毒素 药物等 介导T淋巴细胞 LAK细胞或毒素与药物发挥细胞毒作用 双功能抗体在治疗肿瘤 自身免疫病 病毒性疾病中将会产生巨大的应用价值 五 抗体融合蛋白 抗体融合蛋白广义属双功能抗体 类型 配基 配基型融合蛋白 配基 Ig型嵌合蛋白 较为成熟 配基 FV型融合蛋白 受体 FV型融合蛋白 酶 抗体型融合蛋白 当抗体和酶的融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药物 其优点是提高肿瘤区域的药物浓度 降低对正常细胞的毒性 该方法可使药物浓度在肿瘤部位提高10倍 而在正常组织中降低2 3倍 构建抗体融合蛋白的基本原则 将第一个蛋白的终止密码子删除 再接上带有终止密码子的第二个蛋白基
