第四章 酶联免疫测定法

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1、第四章酶联免疫测定法 经典的化学分析方法 滴定分析 重量分析 简单的吸光光度法 是以简单离子或分子为检测对象的常量或微量分析 面对生物体系成分复杂且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力 于是 一系列针对生物体系中化学成分的测量方法应运而生 免疫化学分析即其重要成员 它将免疫学知识与化学分析手段有机结合 为生命体系中高特异性 超微量的分析提供了解决方法 基本概念 抗原 抗原是指进入人或动物机体后 可刺激机体免疫系统发生免疫应答 从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞 并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质 抗体 是由抗原刺激动物的免疫系统后 由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合

2、的免疫球蛋白 1 1抗原抗体反应的基本特性 1 1 1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡 其反应式为 Ag Ab Ag Ab 高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合 两者结合牢固 不易解离 解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性 1 1 2特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间 化学结构和空间构型互补关系 具有高度的特异性 测定某一特定的物质 而不需先分离待检物 1 1 3最适比例 1 1 4敏感性 化学比色法的敏感度为mg ml水平酶反应测定法的敏感度约为5 10 g ml标记的免疫敏感度可提高数千倍 达ng ml水平例

3、如 HBsAg 其敏感度可达0 1ng ml 第一章概述 1标记免疫技术 将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物 例如放射性核素 荧光素 酶等 进行标记 试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后 不必测定抗原抗体复合物本身 而是测定复合物中的标记物 这种免疫技术 称为标记免疫技术 2标记免疫技术的分类 按标记物分类 同位素标记荧光素酶标记等等 放射免疫技术 发光免疫技术 酶免疫技术 三大经典标记技术 三大经典标记技术 放射免疫技术 放射免疫技术是利用放射性核素的可探测的灵敏性 精确性 抗原抗体反应的特异性组合而创建的一类免疫测定技术医学生物学超微量分析的里程碑 放射免疫技术分为 放射免疫分析免疫

4、放射分析 放射免疫分析的测定原理 Ag AbAg Ab Ag 待测品 Ag Ab R R 将标记抗原 Ag 和未标记抗原 Ag 与特异性抗体 Ab 相混合 结果形成标记的和未标记的抗原抗体复合物 标记和未标记的抗原竞争与抗体进行结合的现象 成为竞争性抑制作用 Ab限量 Ag 定量 Ag 和Ag的量大于Ab结合位点 二者通过竞争方式与Ab结合 随着Ag增加 Ag 与Ab结合形成Ag Ab复合物的放射量降低 二者变化成函数关系 放射免疫技术的应用 放射免疫技术的特异性强 精密度好 灵敏度高 10 9 10 15g L 对半抗原和抗原的测定及仪器设备条件要求不高 是基层医院测定超微量物质的主要手段

5、常用于各种激素 微量白蛋白 肿瘤标记物和药物等微量物质的检测 放射免疫技术的缺陷 放射性核素半衰期短 试剂有效期短 通常为一个月 由于标记物的不断变化 使试剂批间 批内差异大 标准曲线无法保存备用 放射免疫使用放射性核素标记 需要一定的防护及废物处理措施 结果测定依靠时间的累计 至少每一样本一分钟 无法进行自动化分析 第二节酶联免疫法 免疫酶技术 酶标记试剂制备容易 稳定 有效期长 免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验 可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定 所得结果比较客观 一 酶免疫测定法的概念和分类把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来 将酶与抗体或抗原用交联剂结合起

6、来 形成酶标抗体或抗原 这种抗原或抗体与体内或者固相上的抗体或抗原特异性结合 加入相应的酶底物时 底物被酶催化生成有色产物 根据呈色深浅来判断待测抗原或抗体的活性和浓度 酶免疫技术 酶免疫组化 酶免疫测定 均相 非均相 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定 组织切片或其它标本中抗原的定位 液体标本中抗原或抗体的定性和定量 均相法 不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法 异相法则需分离后测定 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann 荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法 即酶联免疫吸附测定法 enzyme linked

7、immunosorbentassay ELISA ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题 它是一种特殊的试剂分析方法 是在免疫酶技术 immunoenzymatictechniques 的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术 ELISA的基本原理和方法 ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例 ELISA ELISA的基本原理有三条 1 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面 可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附 并保持其免疫学活性 2 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物 而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性 3 酶结合物与相应抗原或抗

8、体结合后 可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在 而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的 因此 可以按底物显色的程度显示试验结果 用于定量测定 在这种测定方法中有3种必要的试剂 固相的抗原或抗体 免疫吸附剂 酶标记的抗原或抗体 标记物 酶作用的底物 显色剂 测定的对象可以是抗体也可以是抗原 标本 标本 酶标抗体 底物 显色有色为阳性 显色有色为阳性 酶标二抗 底物 测量时 抗原 抗体 先结合在固相载体上 但仍保留其免疫活性 然后加一种抗体 抗原 与酶结合成的偶联物 标记物 此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性 当偶联物与固相载体上的抗原 抗体 反应 结合后 再加上酶

9、的相应底物 即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色 颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比 因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原 这种有色产物可用肉眼 光学显微镜 电子显微镜观察 也可以用分光光度计 酶标仪 加以测定 其方法简单 方便迅速 特异性强 ELISA的种类和变化 一 双抗体夹心法 二 间接法 三 竞争法 四 双位点一步法 假阴性 五 捕获法测IgM抗体 六 应用亲和素和生物素的ELISA 1 双抗体夹心法方法 用已知抗体包被 加入待测抗原 再加酶标抗体 加底物显色应用 这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位 因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用 而另一端则要与酶标记特

10、异性抗体作用 因此 不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定 乙型肝炎表面抗原 甲胎蛋白 HCG等 ELISA检测抗原的方法 1 已知抗体包被于载体表面 3 加酶标抗体与抗原结合 4 加酶作用的底物产生颜色 2 加待检物抗原与抗体结合 4 加酶作用的底物不产生颜色 双抗体夹心法测抗原 1 已知抗体包被于载体表面 2 加待检物无抗原与抗体结合 3 加酶标抗体无抗原结合 Y Y E Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 获得待分析物的未标定抗体 将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点 洗

11、涤并除去未结合的封闭蛋白 加受检标本 抗原 形成固相抗体 抗原复合物 洗涤除去其他未结合的物质 加酶标抗体生成抗体 待测抗原 酶标记抗体的复合物 彻底洗涤未结合的酶标抗体 加底物进行酶催化反应 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定 2 间接法方法用已知抗原包被 加入待测血清 再加酶标的抗人IgG 抗抗体或二抗 加底物显色 优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用常用于HCV抗体 HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定 ELISA检测抗体的方法 1 已知抗原吸附于载体表面 2 加待检物无抗体与抗原结合 3 加酶标抗Ig与抗体结合 4 加酶作用的底物产生颜色 1 已知抗体吸附于载体表面

12、2 加待检物有抗体与抗原结合 3 加酶标的抗Ig抗体 4 加酶作用的底物不产生颜色 间接法测抗体 Y E Y 包被固相载体 用已知抗原包被固相载体 加待检标本 使相应抗体与固相抗原结合洗涤 除去无关的物质 加酶标抗抗体 与固相载体上抗原抗体复合物结合 洗涤 除去未结合的酶标抗抗体 加底物显色 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定 竞争法方法 用已知抗体包被 加入待测血清 再加酶标抗原 酶标抗原与待检物竞争与包被物结合 加底物显色 应用 用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原 药物 激素等 ELISA检测抗原的方法 竞争法测抗原 Y Y Y Y Y Y Y Y E Y 2 加待检物抗原与酶

13、标抗原竞争与抗体结合 3 加酶作用的底物不显色或显色弱 3 加酶作用的底物显色 1 已知抗体包被于载体表面 1 已知抗体包被于载体表面 2 加待测物和酶标抗原 酶标抗原与抗体结合 用已知特异性抗体包被固相载体 测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合 分别洗涤除去未结合的成分 加底物显色 分别测定两管的吸光度值 根据对照管与测定管吸光度值之比 计算标本中待测抗原含量 对照管由于只加酶标抗原 与固相抗体充分结合 故分解底物显色深 测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异 如待测抗原量多 竞争性地抑制酶标抗原与

14、固相抗体结合 使固相上结合的酶标抗原量减少 因此 加入底物后显色反应较弱 ELISA方法类型及应用 双抗体夹心法 检测抗原最常用的方法 适用于检测两个以上抗原决定簇的多价抗原 间接法 是测定抗体最常用的方法 竞争法 可用于抗原和半抗原的定量测定 也可对抗体进行测定 ELISA中有三个必要的试剂 免疫吸附剂 结合物和酶的底物 1 已包被抗原或抗体的固相载体 免疫吸附剂 2 酶标记的抗原或抗体 结合物 3 酶的底物 4 阴性对照品和阳性对照品 参考标准品 第四节ELISA的技术要点 固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法 固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相

15、载体的表面 1 固相载体 要求 结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行 快速经济 种类 塑料制品微颗粒膜载体 固相载体 固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能 抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性 聚氯乙烯 聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高 但空白值也略高 良好的ELISA板应该是吸附性能好 空白值低 孔底透明度高 各板之间 同一板各孔之间 同一板各孔之间性能相近 3 1 2包被的方式 将抗原或抗体固定在过程称为包被 coating 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的 靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与

16、固相载体表面的疏水基团间的作用 包被用抗原 天然抗原 重组抗原和合成多肽抗原三大类 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段 一般只含有一个抗原决定簇 纯度高 特异性也高 但由于分子量太小 往往难于直接吸附于固相上 借助于偶联物与固相载体的吸附 间接地结合到固相载体表面 包被用抗体 IgG对聚苯乙烯有强吸附力 其联结发生在Fc段上 抗体结合点暴露于外 封闭 封闭 blocking 是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程 封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙 从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附 常用封闭剂 0 05 0 5 的BSA 10 的小牛血清或1 明胶 脱脂奶粉 比较价廉 可以高浓度使用 5 酶免疫技术的核心组成部分 酶结合物 conjugate 酶标记物 通过化学反应或免疫学反应 让酶与抗体或抗原形成的结合物 2 酶标记抗体或抗原结合物 3 2结合物 即酶标记的抗体 或抗原 是ELISA中关键的试剂 对制备方法的要求 1酶的催化活性 不影响 2抗体 或抗原 的免疫活性3不含有或少含有游离的抗体 或抗原 4结合物尚要有良好的稳定性 3 2 1