第六章 亚病毒感染因子

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1、第六章亚病毒感染因子Subviralagents 非细胞生物 朊病毒 只含蛋白质一种组分prion 亚病毒 Subvirus 至少有核酸和蛋白质两种组分 类病毒 只含具有单独侵染性的RNA组分viroid 卫星病毒 卫星RNA 天生缺陷病毒 satellitevirus包括卫星RNA 真病毒 Euvirus 疯牛病 MadCowdisease 一 类病毒viroid 1922年发现 减产20 70 潜伏期长 提纯和电镜观察无病毒粒子瑞士学者T O Diener1971年发现马铃薯纺锤形块茎病的病原是一种只有侵染性小分子RNA而无蛋白质的感染因子 称为类病毒 viroid PSTV 类病毒经带毒

2、叶片 种子以及媒介昆虫传播 可引起马铃薯 西红柿 苹果 柑桔 椰子等多种经济植物严重病害 Potatospindletuberdisease PSTD T O Diener几项研究试验 1967 1971 用番茄研究 1 超离心 2 有机溶剂处理 3 酚处理 4 核酸酶处理 5 密度梯度离心 105000 g仅10 在沉淀中 去脂肪 沉降系数不变 RNase处理 丧失活性 蛋白变性 侵染活性更高 PSTV沉降系数7 10S 定义 类病毒是一个裸露的闭合环状RNA分子 它能感染寄主细胞并在其中进行自我复制使寄主产生病症 类病毒的分子量小 仅为最小RNA病毒的十分之一 约10万Da 类病毒是共价闭

3、合的单链环状RNA分子 大小为246 399个核苷酸 所有的类病毒RNA没有mRNA活性 不编码任何蛋白 马铃薯纺锤形块茎病类病毒 Potatospindletuberviroid PSTV 提纯后的PSTV在电镜下观察 脲展层 长50nm的棒状dsRNA分子 由2个互补的半体组成 一个含179个核苷酸 另一个含180个核苷酸 两者间有70 的碱基以氢键方式结合 形成122个碱基对 整个棒状结构中有27个内环 最大的螺旋含8个碱基对 最大的内环含有12个核苷酸 PSTV的结构 类病毒的分类 目前ICTV公布的类病毒有27种 分为2个科 7个属 1 马铃薯纺锤形块茎类病毒科5属2 鳄梨白斑类病毒

4、科2属 类病毒病诊断和鉴定 Koch spostulates1 在病体中找不到细胞和体细胞的致病因子 可机械摩擦或昆虫媒介传染2 检测小分子核酸5S 7S 区别于植物的RNAPAGE浓度5 10 20 一般病毒2 3 接种电泳带酚抽提液接种敏感寄主4 提纯 生产实际诊断的几种方法 1 指示植物2 凝胶电泳 应用广 但手续复杂 3 互补DNA 精确 适用 分子杂交 有已知类病毒RNA 类病毒的提纯 酚相 去掉 样品上清 去掉 酚相 去掉 水相沉淀离心水相离心 上清沉淀 上清 去 沉淀 类病毒 RNA 乙醇 各种RNA DNaseSDS酚 LiCl 大分子RNA buffer酚 SDS 冷乙醇 破

5、坏寄主DNA去酶蛋白 类病毒致病性机理 类病毒RNA分子直接干扰寄主细胞的核酸代谢类病毒也能结合到前mRNA的识别位点上 干扰mRNA的加工类病毒的 RNA和 RNA还能作为寄主基因组DNA模板的竞争者 与依赖于DNA的RNA聚合酶 结合 使之指导类病毒的复制 破坏了mRNA的合成 类病毒复制 类病毒的遗传信息不足以编码任何复制酶健康植物中含两种类型的RNA合成系统 1 依赖于DNA的RNA聚合酶 和 2 依赖于RNA的RNA聚合酶类病毒RNA在分子内的高度碱基配对和G C含量 使其非常象DNA分子 寄主的依赖于DNA的RNA聚合酶可能以其作模板合成类病毒的RNA 类病毒复制的滚环理论 RNA

6、 RNA寡聚物 RNA寡聚物 裂解成 RNA单位长度的线状分子 共价闭合环状分子 类病毒前体 末端修饰 环状类病毒进入宿主细胞后 首先以 链类病毒为模板转录生成多个单位长度的 链复制中间体 其 链复制中间体有两种可能的命运 先被切割 再环化 链复制中间体先被切割生成单位长度的线状 链分子 再自我环化 然后以环化 链为模板转录出多个单位长度的 链复制中间体 再进一步修饰和连接 形成具有感染性的单体环化的类病毒分子 先转录 再被切割修饰 多个单位长度的 链复制中间体直接转录生成 链复制中间体的模板 然后剪接修饰 鳄梨白斑类病毒ASBVd 链和 链复制中间体中均发现有锤头样核酶结构 因此推测ASBV

7、d可能是采取第一种复制途径 而PSTVd可能是利用第二种复制途径 类病毒复制的滚环理论 类病毒的起源 推测 设想 1 原始生命形态非生命 类病毒 病毒 原始细胞 2 起源于寄主核酸存在于细胞核 与寄主核酸同源性高3 起源于病毒核酸缺失编码外壳蛋白的基因 RNA噬菌体核酸复制 类病毒病的防治 1 综合防治避病 防侵染 培育无病种苗 防治传播介体2 抗病品种3 药剂 微量元素ZnSO4 H3BO3 CuSO4等4 弱毒株保护 二 朊病毒prion 美国动物病毒学家Prusiner1982年研究羊的瘙痒病 Scrapie 病原 核酸酶 蛋白酶 紫外线和其它化学因子处理 时发现的一种对人有侵染性的蛋白

8、质颗粒 称为 Prion Proteininfection的缩写 或 Virion 译为 朊病毒 或 毒朊 Prusiner1997年因此获诺贝尔生理和医学奖2004年Prusiner证明 将提纯的朊病毒注射到基因工程小鼠的脑中时 可以引起脑病 该项研究发表于2004年7月30日Science 二 朊病毒prion 人和哺乳动物朊病毒病的潜伏期特别长 一般为数月乃至数10年时间 病程进行缓慢 由朊病毒感染中枢神经系统所产生的病理学特点为 神经原 神经轴索 星状细胞 树枝细胞呈进行性空泡化 神经胶质增生 细胞外淀粉样变性蛋白沉积 形成光镜下可见的病理学特征如羊搔痒病呈现羊搔痒病相关纤丝 scra

9、pic associatedfibril SAF CJD则表现为淀粉样蛋白斑 amyloidplaque 其实质均为传染性朊病毒蛋白的团块 朊病毒在电镜下呈杆状颗粒 直径25nm 长100 200nm 一般为125 150nm 杆状颗粒不单独存在 总是呈丛状排列 其大小和形状不一 有的丛含有多达100个杆状颗粒 朊病毒蛋白 PrP 是由一种分子量为33 35kD的正常细胞蛋白prpc发生构型转变形成的 由于它类似于羊搔痒因子 故又称为prpsc 朊病毒蛋白 prionprotein PrP prpsc是prpc的异构体 2者的一级结构和分子量大小完全相同 prpsc在蛋白酶解作用下切去N端序列

10、 可生成prpsc27 30kD prpsc27 30kD是一种蛋白酶抗性蛋白 proteinase resistantprotein 该蛋白能够聚合成电镜下可见的棒状淀粉样蛋白 正常的prpc与prpsc之间在构型上的差异主要表现为 螺旋含量减少 折叠的含量增加 朊病毒蛋白 Prionprotein PrP 朊病毒蛋白 Prionprotein PrP 侵染性的朊病毒的单体含有3个或少于3个prp分子 而杆丛聚合体可能含多到105个prp分子 其半感染剂量 ID50 介于10 100个杆状体 朊病毒的分子量为27 30kDa 提纯的朊病毒用刚果红染色 在光学显微镜下可看到许多无定形结构 大小

11、为1 20 m Prp具两种形式prpc和prpsc 来源于同一个基因 宿主染色体基因编码 人的prp基因定位于20号染色体的短臂上 朊病毒蛋白 Prionprotein PrP prpc是一种细胞膜结合的糖蛋白 但通过膜内陷可进入细胞内 通常位于细胞内的prpc是可溶性蛋白 在神经系统中的可能作用 参与神经系统功能的维持通过抗氧化途径而保护神经系统细胞免受氧化损伤 PrPc通过与铜原子形成复合物而发挥抗氧化活性参与淋巴细胞的信号转导参与核酸代谢PrPC可能具有调整程序细胞死亡的功能 PrPc的生理功能 PrP27 30是羊搔痒症致病因子证据 1 核酸酶 蛋白酶 紫外线和其它化学因子处理2 用

12、生化方法与搔痒因子共纯化 其浓度与传染力在正相关3 PrP27 30的分解动力学与传染性相同4 亲和层析纯化的PrP27 30具有传染性5 用中和抗体中和PrP27 30其传染性消失 溶于非变性洗涤剂 与特异的抗体反应 不释放 可从膜释放 依赖GPI 糖基磷酸肌醇 附着细胞膜 部分耐受 蛋白酶消化 prpsc prpc 性状 Prp构型变化导致蛋白质性质变化 prp功能 学习和长期记忆的保持所必须CJD GSS痴呆 这些功能的丧失 朊病毒蛋白的传染过程 少量PrPSc与细胞PrPc结合后 以PrPSc为模板 使PrPc发生明显的构象改变而转变为PrPSc PrPSc传染扩增 最后使PrPc全部

13、转变成不溶性的PrPSc 脑组织形成淀粉样斑块直至死亡 PrPc转变成PrPSc后造成PrPc缺失 使得 神经细胞SOD酶活性下降 从而对超氧化物等所造成的氧化损伤的敏感性增加神经细胞对高谷氨酸和高铜毒性的敏感性增加 综合导致神经细胞死亡变性 PrPc分子 圆圈左侧 与PrPSc分子 圆圈右侧 相互作用 并转化为后者的循环过程 PrPSc分子通过形成长纤维 右 的方式破坏正常的脑组织 左 2005 4 22 cell 传染过程 PrPc PrPsc 朊病毒蛋白质的构象转变假说 1 种子 模型2 重折叠模式 1 种子 模型prpsc充当 种子 prpc单体构象比prpsc更稳定在没有 种子 存在

14、时 固有的PrPC和极少量PrPsc单体之间发生快速的可逆性构象变化 当条件适宜时 PrPsc分子之间可互补缔合而变得稳定 从而使平衡式向PrPsc方向反应 直至形成一稳定的 种子 这个 种子 可通过互相粘着而继续生长 最后碎裂成小的感染单位 此模式能解释经脑内潜育后才发病的朊病毒疾病 已有科学实验支持 2 重折叠模式模板介导的转换过程依靠催化PrPc或一个不稳定的中间体的重排来提高转换 以形成更稳定的PrPsc构象 能解释由于点突变而引起的遗传性朊病毒病 点突变的发生增加了不稳定的中间分子的数量 同时加快它转换成PrPsc的速率 但此模型还无科学实验支持 朊病毒研究进展 科学家首次观察到朊病

15、毒入侵脑细胞的活动将标记后的prpsc加入到培养的神经细胞中观察并用共焦显微镜照相 利用激光来扫描荧光样品 并获得清晰的三维图像 绘制1000多张不同的图像并将获得的照片作成录像 显示出了prpsc进入细胞 沿着窄小的神经突前进并最终进入最接近的邻居细胞的过程2005 5 25JournalofNeuroscience朊病毒传染性与蛋白分子大小有关 prpc以单分子状态存在 对机体没有任何危害 但变异prpsc会多个分子聚集在一起 14至28个蛋白分子 然后扭曲变形 变异的朊病毒颗粒 会吸引单分子状态存在的prpc并将其 同化 最终使动物脑组织海绵化 产生许多孔洞 2005 9 8Nature

16、 朊病毒研究进展 淋巴结是传播朊病毒的关键淋巴结是传播少量朊病毒到神经系统的关键所在 不能排除 淋巴结和朊病毒在身体内向其它非神经组织传播有关 2007 9 25BMCVeterinaryResearch致死型朊病毒传播中的关键蛋白被发现有一种蛋白可能是朊病毒中关键蛋白 裂解感染性蛋白生成 种子 片段 然后侵袭脑组织致宿主迅速死亡 传播过程中还存在另一关键步骤 朊病毒复合物的裂解片段的存在 朊病毒复制需要有热休克蛋白 Hsp104 参与 可能具有这种蛋白 粉碎机 的功能 2007PLoSBiology 朊病毒研究进展 找到疯牛病致病新病毒 欧洲分子生物学组织杂志 2007 10除了已知的被称为PrP的朊病毒蛋白外 新发现了另一种被称为 沙杜 Shadoo 的朊病毒蛋白 像疯牛病这样的朊病毒疾病 我们在许多方面都尚未搞清 比如正常的朊病毒蛋白有哪些功能 朊病毒如何在动物之间进行传播 以及如何导致脑细胞死亡等 希望新的沙杜朊病毒的发现 会在这些重要问题上给我们新的启迪 朊病毒研究展望 已经从结构水平上认识朊病毒 PrPC的结构 折叠动力学和可能转变成PrPsc的折叠途径 蛋白酶消化敏感性实