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1、大环内酯类抗生素对绿藻属浮游植物生长特性的影响研究 林榕梅，庄建梅，陈森，邱育苗 指导老师：刘爱芬 （漳州师范学院化学与环境科学系，福建漳州 363000） 中文摘要：利用室内培养实验,研究不同抗生素浓度处理下斜生栅藻叶绿素含量、可溶性蛋白含量的变化规律。结果表明，它们的适宜抗生素浓度为0.08（mgL - 1 )有利于藻类生长及叶绿素合成,抗生素浓度大于0.08（mgL - 1 )小于 0.18（mgL - 1 )时，促进作用减弱。抗生素浓度大于0.18（mgL - 1 )时，抑制作用加强。 关键词：可溶性蛋白 叶绿素 红霉素 斜生栅藻 抗生素大量存在于在畜禽粪便和施用粪肥的土壤中。王冉等（
2、2009）的研究结果表明, 肉鸡经饲料服用金霉素后有较高比例金霉素以原形形式随排泄物排出,且不易被降解, 排泄物中高含量金霉素残留存在着较大的环境风险。本实验选用红霉素肠溶片，购买于药店。红霉素,白色或类白色结晶性粉末，无臭，味苦，微有吸湿性。熔点130140(分解)。旋光度-70-78(c=2，乙醇)。易溶于乙醇、氯仿、丙酮和乙醚，微溶于水，成盐后溶解度增加。在干燥空气中稳定，遇酸不稳定。 斜生栅藻（Scenedesmusobliquus）是一种常见的浮游藻类，容易培养且对毒物反应敏感，外源污染物对其光合作用、生长速度、酶活性等均有影响（黄国兰等，1994；胡芹芹等，2008）。目前有关抗生
3、素对斜生栅藻生理生化特性的影响尚未见报道.本研究初步探讨了抗生素对斜生栅藻光合色素含量等生理生化指标的影响，为进一步评价抗生素对水生生物的毒性效应及其环境风险积累科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 材料与试剂：供试藻种为斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）引自中国科学院武汉水生生物研究所;红霉素,95%乙醇等。 1.1.2 仪器与设备：722型分光光度计（海大尼科仪器有限公司）、800离心机（江苏省金坛市鸿科仪器厂）培养箱等 1.2 方法 1.2. 1 培养 斜生栅藻在无菌条件下转移至HB-4人工培养液中,于光照培养箱中驯化培养1周,至对数生长期进一步扩大培养
4、,培养条件为:温度28，光暗比12h:12h，光强60Em-2s-1， 静置培养，每天定时人工摇动3 次，在藻种液起始藻密度均为104ind/L,根据预试验加入红霉素溶液，使其终浓度分别为0、0.08、0.18、0.28、0.38、0.48mg L-1，用培养液定容至200ml。每个处理组设置2个平行.静置培养，四天后测定。 1.2.2测定 1）叶绿素含量的测定1 藻细胞的收集：培养96h后每组取25mL藻液，5000rmin-1 冷冻离心10min 收集藻细胞，用蒸馏水洗涤2次，去上清夜。 往离心管中加入少量体积分数为95%乙醇，把藻细胞倒出来，研磨至组织变白，研磨15min。再把此研磨液倒
5、回离心管，用95%乙醇洗净研钵，并用95%乙醇定容至5ml，之后在4000 rmin-1 离心15 min。 测定吸光度：分别取适量上述上清液，用分光光度计于665 nm，649 nm，652 nm 处以浓度95%乙醇作为参比样品液测定吸光度。 计算结果：叶绿素含量由下式计算： Ca+b（mg/L）=1000A652/34.5 34.5为叶绿素a和b在波长652nm处的吸光系数 2）藻液可溶性蛋白含量的测定2 考马斯亮蓝试剂(G-250)的配制:100 mg溶于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL,用蒸馏水稀释至1000 mL,滤纸过滤。最终试剂中含0. 01% (W /V)考马斯亮蓝G
6、-250,4. 7% (W /V)乙醇。 标准蛋白质溶液:称取10 mg牛血清白蛋白溶于0. 15 mol/L NaCl并定容至100 mL制成100g/mL的原液。 标准曲线绘制：取7支试管,按表1操作。摇匀，显色5分钟，在595nm处测定吸光值。绘制标准曲线:以A595 nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。 表1 小牛血清蛋白标准曲线的绘制 0 1 2 3 4 5 6 0.1mg/mL标准蛋白溶液 0 0.15mol/L NaCl溶液 考马斯亮蓝溶液/mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 5.0
7、 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 样品蛋白溶液的制备：取已洗净烘干并已称重的11个离心管。各取藻液50ml，分别放入离心管( 50 mL )中,在冷冻离心机4 000 r /min 转速下离心15min,倒出离心清液,将离心管 1 倒置滴干,分别称重并记录质量。往离心管中加入少量0. 05 mol/L pH 7. 8的磷酸缓冲液,倒出，研磨，再倒回离心管中，定容到5 mL,普通离心机离心,取上清液。 测定样品：:吸取样品提取液各1ml，放入10ml具赛管中，各加入5ml的考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合。进行可溶性蛋白质含量测定。 计算结果 可溶性蛋白含量由下式计算：样品中可
8、溶性蛋白含量(mg/g)(CVl)/(WV2) 注： C：查标准曲线所得每管蛋白质含量（mg） V 1：提取液总体积(mL) V2：红霉素测定时取样体积(mL) W：称样量(g) 2 结果与分析 2.1 叶绿素含量的测定 图1 红霉素对叶绿素含量的影响 96h后，高浓度组与低浓度组相比，藻颜色明显变浅。通过对光合色素含量的测定，其变化如图1所示.红霉素浓度为小于0.18mgL -1 时叶绿素含量比对照组有所升高，叶绿素含量随着加入红霉素浓度的增大而增大，抗生素对藻类的生长起了促进作用。红霉素浓度大于0.18mgL -1 时，色素含量开始下降，与对照组相比含量偏低。表明低浓度抗生素对叶绿素的合成
9、具有一定的影响。其原因可能是高浓度的抗生素浓度 对藻细胞产生了损伤，部分阻断了合成色素的某些途径，导致叶绿体的结构和功能受到破坏，色素分解 2 （Gurbuz et al., 2009;袁祖丽等，2005；张秋英等，2005）。 2.2红霉素对斜生栅藻可溶性蛋白含量的影响 图2 红霉素对可溶性蛋白含量的影响 由图2可以看出随着抗生素浓度的增加，可溶性蛋白含量先增加后降低，在红霉素浓度为0.28mg/L时，可溶性蛋白含量最大，大于这个浓度时蛋白质含量减小。所有浓度组的可溶性蛋白含量比对照组的可溶性蛋白含量高。可溶性蛋白的增高，可以说明浮游植物对于抗生素的胁迫已产生应激反应，可以推断某些酶的活性已
10、经增加，来应对抗生素的胁迫。刘滨扬等研究（2011）显示乳糖酸红霉素可造成苯丙氨酸解氨酶活性下降，并使各类次生代谢产物含量降低，其中对类黄酮的影响最大；而盐酸环丙沙星和磺胺甲噁唑则会使苯丙氨酸解氨酶活性及各类代谢产物含量上升，其中盐酸环丙沙星对缩酚酸、黄酮及黄烷醇的影响要强于磺胺甲噁唑，而花青素则对磺胺甲噁唑更为敏感。这些能够支持本实验的结果。 3 讨论 光合作用是微藻得以维持个体生命的能量来源,而光合作用的关键物质是光合色素,光合色素能够吸收光能,合成糖类。抗生素的污染可能会对斜生栅藻造成一定的氧化胁迫（正在研究中）。 缩酚酸等酚类物质是植物体内重要的次生代谢产物，也是植物体内重要的防御性物
11、质（Appel,1993）。酚类物质的酚羟基极易被氧化，因而可以通过还原反应降低环境中的氧自由基含量，终止自由基链式反应，阻止氧化过程的继续，具有很强的清除自由基的能力（Salah et al. 1995）。 酚类物质的代谢与植物体糖代谢的水平密切相关（宰学明等，2002）。 根据对光合系统的研究，高于0.18 mg L-1 红霉素暴露即可使斜生栅藻光合系统综合性能指数下降，合成 3 碳的能力下降，根据碳素营养平衡假说（Carb rb on-nutr tr ient balance hypothesis，CNBH），植物体内碳同化水平下降，导致机体C/N比降低，进而可以导致酚类等以碳为基础的次
12、生代谢产物含量下降（Hamiltlton et al.,2001; Bezemer et al.,2000）；而最佳防御假说（Optical defense theory，OD）也认为，植物体次生代谢是以减少植物生长为成本的，只有在次生代谢产物所能获得的防御收益大于植物生长获得的收益时 ，植物体才会选择产生次生代谢产物（Bartrto and Cipollllini,2005）。 在本研究中，将进一步研究红霉素暴露使缩酚酸、类黄酮等次生代谢产物的影响，揭示红霉素使藻类糖类合成水平降低，无法提供多余的碳架进行各类次生代谢产物的合成。 当植物体受到氧化胁迫时，缩酚酸、类黄酮等酚类物质的含量会有显著
13、的提升（Yamaji et al.， 2003）。苯丙氨酸解氨酶是植物体次生代谢，特别是苯丙烷途径的限速酶和关键酶，与植物抗逆性密切相关。亦作为下一步研究的对象 红霉素处理后的斜生栅藻叶绿素含量下降，导致光合产物合成受到抑制，导致次生代谢活性整体下降。而可溶性蛋白的含量升高，说明一些酶的酶活性的上升，进而可能引起各类次生代谢产物含量的增加。一些有机污染物可诱导植物体内一些与解毒有关的细胞色素P450，如CYP73、CYP75等基因的表达量上升（Siminszky，2006；Xiang，et al. 2006; Okeefe et al.,1994）。通过对红霉素的研究发现,在实验浓度范围内，红
14、霉素对斜生栅藻的生长有不同程度的抑制作用, 结果表明，低浓度的抗生素浓度对绿藻有促进作用。通过进一步研究，逐渐完善抗生素对藻类的作用机制。 参考文献 1 牟文，熊丽*，胡芹芹，周巧巧，杨雪，张灿，刘德立. HgCl2 对斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）生理生化特性的影响J.生态毒理学报.2009,4(6): 854-859 2 许晓路,蔡振宾,李月香等.稀土钐对若干淡水藻类的毒性作用研究 J . 环境污染与防治, 1995, (3) : 28 - 30. 3 王冉，魏瑞成，刘铁铮和王恬. 金霉素在鸡排泄物中的残留及降解动态.南京农业大学学报. 2009，32（1）：16-2
15、0 4 黄国兰，戴树桂，孙红文，等.有机污染物对藻类毒性的测定J.环境化学，1994，13（3）：259-262. 5 胡芹芹、熊丽、田裴秀子、李文英. 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对斜生栅藻的致毒效应研 4 究 . 生态毒理学报,3(1):8792 6 袁祖丽;Cd, Pb污染对烤烟生理特性及生长发育的影响D;河南农业大学;2006. 7 张秋英,李发东,高克昌,刘孟雨,欧国强.水分胁迫对冬小麦光合特性及产量的影响,西北植物学报,2005,(1):1184-1190 8 刘斌扬等. 3种抗生素对羊角月牙藻次生代谢的影响。应用与环境生物学报 2011，16 ( 6 ): 765769 9 Appel HM. Phenolics cs in ecological interact ct ion: The import rt ance of oxidation. J Chem Ecol, 1993, 19: 152115
