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1、PCR的常见问题分析与对策PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq 敢种 剂，模板中蛋白质?有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理 ，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应 固定 不宜随意更改。
2、 酶失活：需更换新酶?或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够 而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高 ，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有 引物条带出 现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条 带，此时做P CR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条 亮度低，在
3、稀释 引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏 部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二 聚体等。 Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异 性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应 用多 大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要
4、，如变性温度低，变性时间短，极有可能出 现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响 引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增 仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 “行 列变异：如靶序?发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结?，或因靶序列 某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的
5、序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳 性。 需重新设计引物。 “行 列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的 交 叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止 将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或 器 材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本 前， 反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些 小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产 物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非
6、特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多 有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出 现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低 酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提 高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状
7、带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有： 减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。 Possible Causes: Components 可能原因之一反应组分 Primer concentration is too high. Primer degeneracy is too high. Nested primers are required. New primers are required. Some primers are immune
8、tooptimization and its possible that your primers are good matches to other sites in addition to the desired template. See Primer Design. Template denaturation efficiency is too low. Mg+ concentration is too high. Try decreasing the Mg+ concentration by 0.2 mM increments. dNTP concentration is too h
9、igh. Polymerase concentration too high. pH is suboptimal. Check at higher and lower levels.Possible Causes: Conditions 可能原因之二反应条件 Annealing temperature is too low, causing mispriming. Try using a much higher annealing temperatures , especially in the first few cycles. Cycles periods are too long. To
10、o many cycles. Compare the number of bands and their relative amounts after fewer cycles. There may be excessive template if proportionally more of the intended product is present at the earlier cycles. Ramp speed is too slow. Check your thermocyclerspecifications. Inhibitors are present and/or concentrations are too high. See About Inhibitors Enhancers are required. See About Enhancers. Contaminants are present. See How to Reduce Contamination. Hot Start or Touchdown PCR is required.
