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1、核黄素微生物发酵工艺动医104班 国梦婕摘要：本文简介了核黄素的理化特性，概述了其在动物生长、饲料、疾病防治等方面的作用，重点介绍了微生物发酵产核黄素生产工艺的特点，工艺过程，设备，质量检测等内容，并展望了其发展。关键词：核黄素；生产工艺；微生物；发酵核黄素又称维生素B2（VB2）、维生素G或乳黄素，属于水溶性B族维生素，1920 年被第一次发现，1931 年第一次从卵蛋白中分离出来，1935 年核黄素的化学结构被鉴定1。其辅酶形式是黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸。核黄素是自然界中存在广泛的一种氨基酸，是哺乳动物必需的一种营养物质。与其它的B族维生素相同，核黄素在动物体内的储存是有限的，因此
2、，需要每日由饮食提供。1核黄素的分子结构及理化特性1.1核黄素的分子结构核黄素的分子式是C17H20O6N4，分子量为376.36。系统命名为7,8-二甲基-10-（1-D-核糖基）-异咯嗪。1.2核黄素的理化特性核黄素是一种黄色到橙黄色细针状晶体，微臭，微苦，是一个核糖醇侧链的异咯嗪的衍生物。其在常温下稳定，在278282 熔融并且分解（约在240 时变色），并且不受氧气影响。核黄素微溶于水，在27.5 下，溶解度为12 mg/100mL，核黄素水溶液呈黄色并有绿色荧光。其稍溶于乙醇、环已醇、苯甲醇、乙酸，不溶于乙醚、氯仿、丙酮和苯，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液，在碱性溶液中容易
3、溶解，在强酸溶液中稳定。耐热、耐氧化。光照及紫外照射引起不可逆的分解。2核黄素的生物作用核黄素是机体必需微量营养素之一，具有广泛的生理机能，被世界卫生组织（WHO）列为评价人体生长发育和营养状况的六大指标之一。在生物体内，核黄素以黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸的形式存在，直接参与碳水化合物、蛋白质、脂肪的生物氧化作用，在生物体内具有多种生理功能。因而核黄素在食品、饲料、医药工业等方面具有广泛的应用前景2-4。如果机体缺乏核黄素就会影响生物体正常的氧化作用, 引起物质代谢紊乱, 出现一系列的病症, 严重的将会导致死亡。如鸡的核黄素缺乏，就会导致其消化机能衰退，眼与皮肤抗抵力下降，从而使小鸡易患
4、曲爪病，种鸡则会影响种蛋的孵化率。猪的核黄素缺乏，就会导致其生长迟缓，四肢僵硬，皮肤破裂，慢性腹泻，眼睛发炎等。因此，对于集约化养殖来说，核黄素是一种不可缺少的饲料营养成分。在饲料中适当添加核黄素，不仅能够满足畜禽生长和生产的需要，还能在一定程度上降低疾病的发病率。3核黄素生产工艺核黄素较早就实现了商业化生产。目前，国际生产核黄素的工艺方法主要有4种：植物抽提法、化学合成法、微生物发酵法以及半微生物发酵半化学合成法4。其中，微生物发酵法是近年来发展起来的一种经济有效的方法，其生产核黄素具有设备简单、对环境无污染、成本低、生产周期短、产品纯度较高等优点，已经成为国内外工业生产核黄素的发展趋势。以
5、下将对微生物发酵工艺进行介绍。3.1微生物菌种自然界中，可以代谢产生核黄素的微生物有很多，包括真菌（如酵母菌），细菌等，而应用于核黄素工业生产的菌种非常少。在微生物发酵法中，要提高核黄素产量和经济效益的，优良的菌种是必要条件之一5。常用的有棉病阿舒囊霉（Ashbya gossypii）、枯草芽孢杆菌（Bcillus subtilis）和阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii）等（表1）4。表1 核黄素工业生产中常用菌种菌种名称学名分类地位阿舒假囊酵母Eremothecium ashbyii酵母Candida flareri酵母Saccharomyces cerevisiae酵母
6、棉病阿舒囊霉Ashbya gossypii霉菌枯草芽孢杆菌Bcillus subtilis细菌3.2生产过程微生物发酵法生产核黄素，采用三级发酵法。将在25培养成熟的核黄素产生菌的斜面孢子用无菌水制成孢子悬浮液，然后接种于种子培养基中培养（30，3040小时），最后将二级发酵液移种至三级发酵罐发酵（30，160小时），得到核黄素发酵液。培养菌种发酵提纯干燥检验包装成品图1 核黄素发酵生产主要工艺流程3.2.1菌种的选取 随着分子生物技术、基因工程技术等的发展，核黄素生产菌将具备产量高、耗能低、产品纯度低等优点。姜小山等以阿舒假囊酵母为出发菌株，在合成培养基上诱变筛选得到了数株抗嘌呤拮抗物8-A
7、G的突变株，进行传代和摇瓶发酵试验，发现核黄素的产量比出发菌株最高提高15.5%6。由此可见，利用基因工程等手段选取优良菌种，是非常必要且有效的。菌种茄子瓶斜面289d茄子瓶斜面283-4d孢子悬浮液种子罐29-3034-36h发酵罐29-30170d灭菌3.2.2发酵方法的选取 核黄素的微生物发酵法包括两种：固体发酵法和液体深层发酵法。固体发酵法是以豆渣为原料进行生产的，具有工艺设备简单，原料广泛，技术条件要求较低等特点，但又具有生产效率不高，劳动强度大，生产成本较高等缺点。液体深层发酵法适用于机械化大量生产，原料的利用率较高，有利于降低生产成本，但却需要较高的设备条件要求，所需原料量大。图
8、2 深层发酵法生产流程3.2.3核黄素的提取 将核黄素从发酵液中提取出来的方法，主要有四种：重金属盐沉淀法、Morehouse法、酸溶液法和碱溶液法。过去，工业生产中多采用酸溶液法提取核黄素。但由于酸溶液法提取核黄素的耗能较大，经一次溶解、结晶，获得核黄素纯度只有60%70%。章克昌等成功利用碱溶液法提取核黄素，并经二次分离结晶，获得纯度达92.6%的成品，使得核黄素的提取技术极大提高7。碱溶法提取核黄素不仅收益率高，而且能耗低。随着离心分离设备的不断改进，碱溶法分离提取核黄素的优越性将越来越明显。发酵液发酵液预处理热处理或酸处理等碱溶直接分离固液分离（絮凝）（絮凝）（不经预处理）高温冷却倾析
9、式离心机离心过滤膜过滤离心含核黄素的清夜菌体与核黄素的混合物核黄素提取离心吸附洗脱蒸发结晶水玻璃化学沉淀微生物沉淀回调pH值沉淀多次萃取然后冷却核黄素粗晶体核黄素纯化 （溶解粗晶体）加热后冷却氧化回收活性炭吸附后过滤重结晶图3 核黄素分离提纯汇总3.2.4核黄素的测定 测定发酵液中核黄素的含量与质量，主要有四种方法：微生物法、荧光比色法、高效液相色谱技术（HPLC）、核黄素化学发光新方法8。在实际生产过程中，前三种方法，存在的一个很大的缺点是样品的处理和测定都必须在严格的避光条件下进行，并且极易受到干扰。微生物法虽然灵敏度高，检测限低，可以测到0.10mg/L浓度，但微生物的培养较缓慢，处理繁
10、杂。而近年来，化学发光分析方法由于它的灵敏度高、分析速度快、方法简便等特点，越来越受到人们的欢迎。3.2.5核黄素颗粒的制备 微生物发酵生产的核黄素需要干燥才能制成核黄素成品。常用干燥方法大致可以分为两种：喷雾干燥法和普通气流干燥法。张粉艳等研究了核黄素发酵液喷雾干燥的新工艺，采用不同喷嘴孔径可得到不同粒径的颗粒和固体回收率9，通过压力式喷雾器进行干燥制得固体核黄素超细粉末，采用压力喷雾式雾化能生产小颗粒物料，减少细粉飞扬，从而提高干粉回收率，且喷嘴制造简单，加工方便，在工业上有较广的应用。3.3生产设备 利用微生物发酵生产核黄素过程中，用到的设备主要有：冰箱、灭菌锅、试管、三角瓶、摇床、无菌
11、操作间、离心机、压滤机、小型发酵罐（种子罐），大型发酵罐、蒸汽管道等。3.4生产中的注意事项首先，整个生产过程中要严格控制在无菌的条件下进行，抗菌素在加入时温度不能太高，防止抗生素失活；其次，发酵罐在使用之前，要进行严格的灭菌，防止杂菌的污染；第三，发酵罐与培养基的灭菌要分开进行；第四，发酵罐进行高温灭菌时，要注意夹套里注水，防止损坏发酵罐；第五，发酵过程中，要注意pH值的变化；第六，注意溶氧的变化；第七，发酵后期要注意加压以维持氧浓度。4总结与其它方法相比，微生物发酵法也存在一些缺点，例如：在核黄素的后期加工处理过程中，核黄素的分离纯化比较困难，很难制得高纯度的核黄素。因此，用微生物发酵法制
12、得的核黄素主要应用于饲料行业，而用于制药和食品行业的核黄素大部分还是来自于化学合成法。但是随着核黄素分离纯化技术的不断改进，微生物发酵法将以其环保、节能、低成本等优点最终取代化学合成法。参考文献：1. 项昭保, 戴传云, 朱蠡庆. 核黄素生理生化特性及其功能J.食品研究与开发, 2004, 25(12) : 90- 95.2. 童朝阳，徐琪寿. 核黄素的药理作用及应用前景J.军事医学科学院院刊，2003(6):223-2263. 杜留云，裘娟萍. 核黄素在动物中的作用J.江西饲料，2002(2):17-194. 仪宏, 朱文正, 张华峰. 核黄素生产技术发展J.中国食品添加剂, 2003(4) : 14- 17.5. 邱蔚然, 高淑红. 发酵法生产核黄素J.工业微生物, 2000,30(1) : 58- 64.6. 姜小山，孙国萍，王淑君等. 核黄素产生菌阿舒假囊酵母抗反馈抑制突变株的选育J.微生物学报,1997(1):95-1007. 章克昌，吴佩琮，陆文清. 从发酵液中分离提取核黄素J.无锡轻工大学学报，1998(3):26-308. GB/T5009.85-2003. 食品中核黄素的测定S9. 张粉艳，郝红，高新等. 核黄素发酵液喷雾干燥的工艺研究J.西北大学学报（自然科学版）,2002(5):515-518
