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1、食品安全国家标准食品微生物学检验 沙门氏菌检验1 范围本标准规定了食品中沙门氏菌（Salmonella）的检验方法。本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 冰箱：2 5 。2.2 恒温培养箱：36 1 ，42 1 。2.3 均质器。2.4 振荡器。2.5 电子天平：感量0.1 g。2.6 无菌锥形瓶：容量500 mL，250 mL。2.7 无菌带螺旋帽广口瓶：容量500 mL。2.8 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。2.9 无菌培养皿：直径60mm，90 mm
2、。2.10 无菌试管：3 mm50 mm、10 mm75 mm。2.11 无菌毛细管。2.12 pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.13 全自动微生物生化鉴定系统。3 培养基和试剂3.1 缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A中A.1。3.2 乳糖肉汤（LB）：见附录A中A.2。3.3 胰酪胨大豆肉汤(TSB)：见附录A中A.3。3.4 再造脱脂奶粉：见附录A中A.4。3.5 1%煌绿水溶液（BG）：见附录A中A.5。3.6 通用前增菌肉汤（UPB）：见附录A中A.6。3.7 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录A中A.7。3.8 氯化镁孔雀绿大豆（RVS）增菌液：见附录A中A.8。3.9 亚硒
3、酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录A中A.9。3.10 亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录A中A.10。3.11 HE琼脂：见附录A中A.11。3.12 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A中A.12。3.13 沙门氏菌属显色培养基。3.14 三糖铁（TSI）琼脂：见附录A中A.13。3.15 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.14。3.16 尿素琼脂（pH 7.2）：见附录A中A.15。3.17 氰化钾 （KCN） 培养基：见附录A中A.16。3.18 赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.17。3.19 糖发酵管：见附录A中A.18。3.20 邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录
4、A中A.19。3.21 半固体琼脂：见附录A中A.20。3.22 丙二酸钠培养基：见附录A中A.21。3.23 沙门氏菌O和H诊断血清。3.24 生化鉴定试剂盒。4 检验程序沙门氏菌检验程序见图1。样品处理预增菌1 mL+SC 10 mL1 mL+TTB 10 mL36 1 ，18 h24 h42 1 ，18 h24 hXLD（或HE、显色培养基）BS36 1 ，18 h24 h36 1 ，40 h48 h挑取可疑菌落TSI，赖氨酸，NA， 靛基质， 尿素 (pH 7.2)，KCN生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统+反应结果与左侧描述不符H2S-靛基质-尿素-KCN-赖氨酸+/-H2S+
5、靛基质+ 尿素- KCN-赖氨酸+H2S+靛基质- 尿素-KCN- 赖氨酸 +ONPG-甘露醇+、山梨醇+可疑沙门氏菌非沙门氏菌多价血清鉴定血清学分型报告图1 沙门氏菌检验程序5 操作步骤5.1 前增菌5.1.1 解冻和保存样品检验前冷冻样品最好不要解冻，如果冷冻样品必须软化以取其检测部分，应在45 以下不超过15 min，或2 5 不超过18 h解冻。若不能及时检验应置于-15 左右保存。非冷冻而易腐的食品，置于4 冰箱保存。5.1.2 一般样品无菌操作称取25 g（mL）样品，置于盛有225 mL BPW的灭菌均质杯内，以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 mi
6、n，或置于盛有225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需调整pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2。无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 1 培养8 h18 h。5.1.3 肉制品无菌操作称取剪碎后的肉类样品25 g，置于灭菌均质杯内，加入25 mL BPW，以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min，移入盛有200 mL BPW的500 mL广口瓶或其他合适容器内，混合均匀。如需调整pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或
7、HCl调pH至6.80.2，充分混匀。于36 1 培养8 h18 h。5.1.4 即食蛋制品5.1.4.1 冰蛋品 按5.1.2进行。5.1.4.2 干蛋品无菌操作称取25 g样品置于灭菌的500 mL广口瓶或其他合适容器内，加入225 mL乳糖肉汤。如果制品是粉状，加入约15 mL乳糖肉汤，用灭菌玻璃棒、匙或压舌器搅拌，使呈均匀悬液，再加3份乳糖肉汤10 mL、10 mL、190 mL，使总量为225 mL，充分搅拌，直到样品完全悬浮没有团块为止。盖紧瓶盖在室温下静置60 min，振荡使其充分混匀。如需调整pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2，充分混匀。将瓶盖旋
8、松1/4转，于35 1 培养24 h2 h。5.1.4.3煮硬的蛋无菌剥离蛋壳，无菌操作压碎蛋白和蛋黄，称取25 g置于灭菌的500 mL锥形瓶或其他合适容器内，加225 mL TSB，并振荡充分混匀。在室温下静置60 min，振荡使其充分混匀。如需调整pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2，充分混匀。将瓶盖旋松1/4转，于35 1 培养24 h2 h。5.1.5 巧克力类及可可制品无菌操作称取25 g样品置于灭菌的搅拌容器内，加入225 mL再造脱脂奶粉，搅拌2 min。再无菌操作转移搅拌过的混合物到灭菌的带螺旋帽500 mL广口瓶或其他合适容器内。盖紧瓶盖在室温
9、下静置60 min，转动混匀。如需调整pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2，再加入0.45 mL 1%煌绿水溶液混匀。将瓶盖旋松1/4转，于35 1 培养24 h2 h。5.1.6 即食果蔬制品5.1.6.1新鲜的、冷冻的或干的水果和蔬菜无菌操作称取25 g样品置于灭菌的均质器内，加入225 mL乳糖肉汤并均质2 min。再无菌操作转移已均质的混合物到灭菌的带螺旋帽500 mL广口瓶或其他合适容器内。盖紧瓶盖在室温下静置60 min，转动混匀。如需调整pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2，充分混匀。将瓶盖旋松1/4转，于35 1 培养
10、24 h2 h。5.1.6.2 绿叶蔬菜无菌操作称取25 g样品，加入灭菌的广口锥形瓶或其他合适容器内，加入225 mL乳糖肉汤，顺时针和逆时针用力振摇锥形瓶各25次，在室温下静置60 min，振摇混合。如需调整pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.80.2，充分混匀。于35 1 培养24 h2 h。5.1.7 坚果籽实制品按5.1.6.1进行。5.1.8 橙汁、苹果酒和苹果汁等饮料无菌操作称取25 g（mL）样品置于灭菌的带螺旋帽的500 mL广口瓶或其他合适容器内，加入225 mL灭菌通用前增菌肉汤，充分混匀。在室温下静置60 min。不调pH值，于35 1 培养24
11、h2 h。5.1.9 鱼贝类水产品按5.1.6.1进行。5.2 增菌轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB 内，于42 1 培养18 h24 h；乳与乳制品可选择RVS增菌液，移取0.1 mL，转种于10 mL RVS内，于41.5 培养18 h24 h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC内，于36 1 培养18 h24 h。5.3 分离分别用直径3mm的接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板），于36 1 分别培养40 h48 h（BS琼脂平板）或18 h24 h（XLD琼脂平板、HE琼
12、脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板），观察各个平板上生长的菌落，各个平板上的菌落特征见表1。表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板 沙门氏菌 BS琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。XLD琼脂菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。5.4 生化试验5.4.1 自选择性
13、琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果三糖铁琼脂赖氨酸脱羧酶试验培养基初步判断斜面底层产气硫化氢KA（）（）可疑沙门氏菌属KA（）（）可疑沙门氏菌属AA（）（）可疑沙门氏菌属AA/非沙门氏菌KK/非沙门氏菌注：K:产碱，A：产酸；：阳性，：阴性；（）：多数阳性，少数阴性；/：阳性或阴性。5.4.2
14、接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表反应序号硫化氢 （H2S） 靛基质 pH 7.2尿素 氰化钾 （KCN）赖氨酸脱羧酶A1A2A3/注：阳性；阴性；/阳性或阴性。 5.4.2.1 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。 如有2项异常为非沙门氏菌。表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表pH 7.2尿素 氰化钾（KCN） 赖氨酸脱羧酶
