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1、-范文最新推荐- 酵母中海藻糖提取工艺研究+文献综述 摘要：海藻糖是一种新型的生物保鲜剂，广泛存在于各种微生物中。近年来海藻糖工业化发展迅猛，在各个领域都具有广阔的应用前景。海藻糖是一种稳定的双糖，一般从酵母中制取海藻糖。工艺流程一般为高温胁迫酵母使其积累海藻糖→提取剂浸提→冷却、离心→除蛋白、去醇→脱色、离子交换→乙醇结晶→干燥→成品。本文比较了几种海藻糖提取方法中的关键点，包括破壁方法、浸提方法、浸提时间以及提取温度等条件的研究。最后得出了以下主要实验结果：（1）相对高温的环境中酵母会积累海藻糖来保护自身，维持正常的代谢
2、，进入对数生长期的酵母在3036海藻糖积累量最大。过高的温度使酵母死亡，36之后海藻糖积累量下降，高于36之后海藻糖积累量下降，（2）采用酶法破壁（每1g菌体添加30mg蜗牛酶）效果最好，达到了92%的破壁率，但是考虑到大规模工业化生产，微波法（2500MHz，700W，处理2min）具有更高的经济价值，在微波场的作用下酵母破壁率达到了72%的破壁率。（3）三氯乙酸的提取效果优于乙醇和水，并且三氯乙酸浸提后溶液仅存在海藻糖1，提取次数与提取时间的变化也会影响海藻糖的提取效果，最优为XXXXXXX（4）当离心转速在2400rpm时提取效果比较理想，过高与过低的转速都会影响海藻糖的提取效果。527
3、4关键词： 酵母；海藻糖；优化工艺；提取Optimization Study on Extraction of Trehalose from YeastAbstract：Trehalose is a new kind of preservative，widely exist in microorganism. In recent years，The rapid development of industrial production of trehalose brings prospects for persification. Trehalose is a kind of stable di
4、saccharide, can be extracted from yeast. The process of extraction threhalose is Extractant extraction→Cool down→Centrifuge→Remove protein→Removal of alcohol→Bleaching→Ion exchange→Crystallization in ethanol→End product. This article compare a few key points i
5、n method of extraction incould roken methods, extraction methods, extraction time and extraction temperature, obtained the following results: 2.3.7 海藻糖含量确定83 结果讨论83.1 产海藻糖菌株的确定83.2 酵母生长曲线的测定83.3 不同破壁方法的效果93.3.1 酶法破壁93.3.2 冻融法破壁103.3.3 研磨法破壁103.3.4 微波法破壁113.4 海藻糖标准曲线的绘制113.5 选择提取工艺123.6 海藻糖提取工艺的优化124
6、 结论135 心得与展望14致谢14参考文献151 绪论1.1 .1海藻糖的特性海藻糖第一次被发现是在1832年Wiggers从麦角菌中首次提取出来。对于许多微生物来说能否适应相对极端的环境海藻糖起非常关键的作用，它不同于一般糖类，具有非常独特的生物学特性当生存环境变得严苛时（高温、高渗透压、脱水等），它开始大量产生海藻糖。海藻糖可以在细胞表面形成一层独特的保护膜，有效的防止蛋白质变性从而保护生物安全的在严苛的环境中生存下来。海藻糖能在较高的温度下维持细胞的理化特性，并且被广泛用在冷冻复苏、生物试剂、菌种的保存中。1.1.2 酵母产海藻糖海藻糖广泛存在与各种微生物中，一般制取海藻糖多以酵母为生
7、产菌种，它具有廉价、易获得等特点。并且人类运用酵母的历史悠久，对其各种特性都有比较全面的了解。一开始人们认为海藻糖是一种储能糖类，但是随后的研究证实，海藻糖是通过外界刺激产生的是一种应激行为的产物。当外界刺激较强时海藻糖会积累到细胞干重的10%-15%。海藻糖的积累发生在对于生物体而言比较恶劣的条件下，是一种胞内产物。酵母适宜的生长温度为28，当温度过高时酵母细胞内海藻糖酶的活性被抑制，海藻糖得以积累。积累下的海藻糖起到了保护酵母细胞内蛋白质的作用，防止蛋白质热变性。 2008年李静，谭海刚等在从面包酵母中提取海藻糖的研究获得了92.51的提取率。他们在105的条件下加热预处理，时长为为5 h
8、。经过加热预处理后，可以使海藻糖酶失活，并且使酵母的细胞壁和细胞膜都受到一定程度破坏，可以提高海藻糖渗透效果从而提高了提取率，获得了92%的提取率。(2)有机溶剂的影响提取海藻糖时多采用有机溶剂将海藻糖融解，但是过高的有机溶剂浓度会造成酵母细胞质壁分离，阻碍海藻糖的溶出。以乙醇为例，较好的浓度为40%体积分数的乙醇进行抽提，在80的条件下选取11.5h的提取时间能获得较高的提取率。三氯乙酸作为提取剂使用十分广泛，0.5mol/L的三氯乙酸溶液也经常被作为海藻糖的提取剂。(3)不同破壁方法的效果因为海藻糖是胞内产物所以国内外许多研究人员还采用破碎法来释放胞内物质。常采用分步分离提取，细胞破碎技术
9、包括物理的、化学的、酶的和机械的等方法6 . 在选择破碎方法时要考虑裂解操作与下游单元的相互作用，工业化生产还要考虑成本消耗，所以常采用化学破碎法加入三氯乙酸来改变细胞膜透性，使海藻糖渗透出细胞，但是化学法的破碎率不高并且有机溶剂的加入使进一步的萃取加大了难度。酶法破碎细胞壁是今年来研究较多的破碎方法，具有反应时间短、破碎率高、操作便捷等有点。不足之处是酶制剂价格昂贵难以大规模推广。微波破碎法来破碎酵母菌7也收到了很好的效果。此法具有高穿透性和高选择性以及快速性等特点，经过微波场破碎的酵母细胞呈现皱缩状态并且有明显的裂纹出现，酵母细胞壁的结构稳定性与完整性收到了严重的破坏8而采用微波破碎法可以
10、很快的使酵母细胞内的海藻糖酶失活，在微波场中60s即可让海藻糖酶完全失活。 本课题研究酵母中海藻糖的提取工艺，对比不同提取方法、纯化方法得出最优的工艺条件，优化海藻糖生产技术提高海藻糖的产量。简单先进的提取工艺可以使本市的海藻糖产量以及废酵母的处理有长足的进步。图1.1 常见海藻糖生产流程2 实验材料和方法2.1 实验材料2.1.1 菌种和培养基6种酵母菌种均来自上海引用技术学院微生物实验室，1号菌种分离自林下土壤，2号菌种分离自林下腐叶，3号菌种分离自河床淤泥，4号菌种为安琪黄酒酵母，5号菌种为哈尔滨酿酒酵母，6号菌种为安琪果酒酵母。将6种酵母菌分别加入LB液体培养基活化2h。挑取一环活化后
11、的菌到灭过菌的PDA斜面上画线涂布，28培养48小时待菌落成长后冷藏待用。产海藻糖培养基、PDA培养基均购自国药集团股份有限公司。产海藻糖培按照葡萄糖30g, 酵母浸出粉4g, (NH4)2•SO4 4g, KH2PO4 0.18g, Na2HPO4 3g, MgSO4 0.12g, 微量元素溶液3mL(微量元素溶液( / L) : MnSO4 30mg, FeSO4•7H2O 30mg, CuCl2•2H2O 34mg, ZnCl2 30mg,Na2MoO4•H2O 30mg, CaCl2•6H2O 38mg, NiCl2 20mg,NaCl
12、 30mg, CoCl2•6H2O 200mg。)以上培养基在自然pH 的条件下, 121灭菌20min, 葡萄糖单独灭菌。PDA培养基按照胰马铃薯 (加水煮烂后过滤)200g/L，葡萄糖 20g/L，琼脂20g/L配置完成121高压灭菌20min后摆斜面。PCA(平板计数琼脂) 购自上海盛思生化科技有限公司。配置方法为称取本品23.5g，加入去离子水定容至1L，边搅拌边加热直至煮沸并且完全溶解，分装至三角瓶，121高压蒸汽灭菌15min，备用。2.1.2 试剂蒽酮-硫酸试剂，称取2g蒽酮加入到80%H2SO4中，用80%H2SO4定容至1L。三氯乙酸（BR）、无水乙醇（BR）、硫酸
13、（BR）、蒽酮（BR）、海藻糖（BR）均购自上海国药集团股份有限公司。2.1.3主要仪器 2.3.2 测定生产菌株生长曲线在选定菌株斜面培养基上挑取一环接种至产海藻糖培养基中，以空白培养基做对照，OD560测定其吸光度绘制生长曲线。在2h时开始取样，前24h每隔4h取样一次，24h之后每隔12h取样一次。2.3.3 选择破壁方法尝试四种不同破壁方法对酵母细胞壁的破碎情况，以涂布PCA平板计数，1g菌体重悬在10mL蒸馏水中做参照，计算破碎率。（1）酶法破壁取1g（ww）已经积累海藻糖（高温胁迫使酵母积累海藻糖）的酵母菌加入10mL蒸馏水，再加入30mg蜗牛酶。恒温37水浴15min将处理后的菌
14、液重悬，取50μL涂PCA平板。（2）冻融法破壁取1g（ww）酵母菌已经积累海藻糖的酵母菌，加10mL蒸馏水，放入冰箱-16冷冻，待完全冻结后30温水浴融解。如此反复四次，重悬菌液后取50μL涂PCA平板。（3）研磨法破壁将1g（ww）积累了海藻糖的菌体加入到研钵中，缓慢研磨。顺时针30次，逆时针30次，反复30min。仔细刮去粘在研钵表面的菌体加入10mL蒸馏水缓缓洗脱。取50μL涂PCA平板。（4）微波法破壁将1g（ww）菌体用接种环平铺在平板上铺成薄薄的一层，放入微波炉中微波处理2500MHz，700W下3min。加入10mL蒸馏水重悬。取50μL涂PCA平板。2
15、.3.4 绘制海藻糖标准曲线准确称取0.100g标准海藻糖加入蒸馏水定容至100mL。用移液枪分别取0、25、50、100、150、200μL，分别加水至2.0mL，摇匀后加入蒽酮硫酸试剂8.0mL。沸水浴2min测定OD590。2.3.5 选择提取方法将1g酵母菌体微波破碎2500MHz，700W下4min，将经过破壁处理的菌体加水至10mL混匀然后在3000rpm下离心，上清液保留待用。沉淀加入三种不同的提取剂8mL，三氯乙酸、水、乙醇。三氯乙酸在冰水浴中进行，乙醇和水在常温下进行。反复抽提3次，每次20min。最后加入上清液，用蒽酮-硫酸试剂测定海藻糖含量。 图3-2酵母生长曲线3.3 不同破壁方法的效果3.3.1 酶法破壁蜗牛酶是一种联合酶制剂，它含有十几种
