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1、 20L全自动发酵罐枯草芽孢杆菌产淀粉酶实验实 验 时 间：2012年6月17日2012年6月28日学 生 姓 名： xxxxxx 学 号： 院 系： 生命学院 专 业： 生 物 技 术 指 导 教 师： 2012年 6月 30日目录一. 实验目的要求 4二、 实验试剂和仪器 41、种子培养基：57培养基 52、发酵培养基 53、发酵过程中相关参数的测定 6三、实验步骤与方法 61、了解发酵罐系统的结构 62、种子培养 63、发酵罐空消 64.PH电极与DO电极的首次校正 85、发酵培养基的配置 95.1 培养基摇瓶试验 95.2 种子的摇瓶 96.装料 107、实消 108.PH电极与DO电
2、极的再次校正109、接种 1110、设定发酵参数，运行发酵指令 1111、发酵过程中相关参数的记录 1112、发酵过程中取样及相关参数的测定12（1）参数测定所需的溶液的配置12（2）取样 13（3）样品处理 13（4）残糖含量测定（DNS法） 13（5）生物量的测定（比浊法） 14（6）淀粉酶发酵活力的测定 14（7）葡萄糖标准曲线的制作 15（8）麦芽糖标准曲线的制作 1513. 放料, 清洗罐体，空消，保养 16四、实验结果与讨论 17五. 实验心得体会 26一、 实验目的要求：1. 掌握机械搅拌通风发酵罐的基本结构(1) 发酵罐主体(2) 蒸汽灭菌系统：正确把握各阀门的操作(3) 通气
3、系统(4) 加热冷却循环系统：各管道联络关系(5) 搅拌动力系统(6) 智能控制系统2. 掌握发酵罐小试的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种，参数设定3. 掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：pH，DO，温度，搅拌速度，生物量，残糖含量，产物生成量，消泡，CO2。4. 运用所学发酵工程基本理论分析发酵过程中的实验数据，讨论某一特定菌株的发酵规律。二、 实验试剂和仪器1、种子培养基：57培养基试剂及药品：麸皮 50g豆饼粉（牛肉浸膏/粉） 30gNaCl 2 g蒸馏水、斜面培养的枯草芽孢杆菌器材：1000ml烧杯、玻璃棒、100ml锥形瓶（20个）、天平、粉碎机、电热炉、高压灭菌锅、灭
4、菌枪头、1000移液枪、酒精灯、75%酒精、棉球、无菌操作台、封口膜、橡皮筋、恒温摇床、1000ml锥形瓶、标签纸2、发酵培养基：试剂及药品： 麸皮 （3） 320g 12水磷酸氢二钠（0.2） 70.55g 硝酸钾 （0.2） 28g 消泡剂（植物油）（0.3） 42g 蒸馏水器材：1000ml烧杯、玻璃棒、75%酒精、棉花、一次性口罩、打火机、厚手套、天平 3、发酵过程中相关参数的测定的药品、仪器：试剂及药品：无水葡萄糖 0.1g NaOH 4g3水乙酸钠 0.6804g淀粉 1g乙酸、蒸馏水、DNS、PH标准缓冲液、亚硫酸钠器材：10mL具塞刻度试管（30个）、100ml容量瓶（2个）、
5、200ml容量瓶（2个）、100ml烧杯、100ml试剂瓶（4个）、100ml锥形瓶（2个）、玻璃棒、1000ml烧杯、标签纸、电热炉、木夹、试管架、PH标准试纸、PH计、枪头、1000移液枪、恒温水浴锅、分光光度计、电子天平、烘箱、冰箱、上海高机SY-3000发酵系统三、实验步骤与方法1、了解发酵罐系统的结构（1）罐体（2）发酵罐的搅拌系统（3）空气供给系统（4）温度控制系统（5）pH控制系统（6）过程变量的测量（7）灭菌系统（8）测量及控制系统：下位机、上位机、网络通讯2、种子培养（1）称取麸皮50g、豆饼粉（牛肉浸膏/粉）30g（用粉碎机搅碎为粉末）,上述成分混合于1000ml烧杯中，加
6、 NaCl 2 g、蒸馏水1.0L 置于电热炉上煮沸1小时，将pH 自然，待温度下降后分装入20个100ml锥形瓶中，每瓶30ml。将装有培养基的锥形瓶与备好的枪头、玻璃棒一起放入高温灭菌锅灭菌2小时后取出待用。（2）将灭菌后的培养基、枪头、移液枪、玻璃棒、无菌水、酒精棉球、酒精灯放入无菌操作台紫外照射20min后，可将斜面培养的枯草芽孢杆菌接种到新配置的锥形瓶培养基中，贴好标签，放到30恒温摇床中培养2天。3、发酵罐空消空罐灭菌注意事项和准备：i. 在灭菌之前一定要先将夹套的水排掉。ii. 所有罐体上的部件都必须保证是安装可靠的，以防罐压升高时造成危害。iii. 空罐灭菌时，pH、DO电极应
7、取下，这样可以延长使用寿命。iv. 将罐体及管路上的所用阀门都关闭。v. 调整好液位和消泡电极的位置并旋紧。如果不用，则可拆下并用堵头封住；检查蒸汽是否满足要求。步骤：（1）发酵罐、空压机电源打开；（2）打开蒸汽发生装置，发酵罐与蒸汽发生装置的通水阀门打开，并检查蒸汽发生装置水箱是否满，注意蒸汽发生装置的压力表读数。打开蒸汽发生装置的旁通阀使冷空气排出，排完即关。（3）打开发酵罐水阀，使水淹没温度电极，排空夹套水。（4）当蒸汽发生装置的压力表读数达到0.40.7MPa，可开启空消，下位机参数设置如下：灭菌温度： 121.0 灭菌时间： 20min停转温度： 90.0 灭菌转速： 0rpm 结束
8、温度： 37.0 结束转速： 150rpm结束压力： 0.05MPa 结束流量： 30L/min尾气开度： 5% 过程流量：5.00 L/min（5）当罐温达到100以上，分别对取样口、轴封、底阀进行消毒，每项10min。取样口消毒：打开取样蒸汽进气阀取下取样口螺盖取样口出蒸汽打开取样蒸汽出气阀拧上取样口螺盖计时10min（正常灭菌状态下取样相通管道会发烫），轴封与底阀的灭菌过程与取样口灭菌操作类似。（6）空消完成后关闭蒸汽发生装置，降温冷却。4.PH电极与DO电极的首次校正（1）配置PH为4.00与6.86的标准缓冲液（2）配置饱和亚硫酸钠溶液（3）PH电极的校正：. 将PH电极放入6.86
9、的标准缓冲液中，在“测量值1”处输入6.86，“当前电压”稳定后，点击“第一点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压1”处。. 将PH电极放入4.00的标准缓冲液中，在“测量值2”处输入4.00，“当前电压”稳定后，点击“第二点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压2”处。. 电击“自动校正”，系统会自动计算出零位和斜率。（4）DO电极的校正：. 将DO电极放入饱和亚硫酸钠溶液中，在 “当前电压”稳定后，点击“第一点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压1”处。. 将DO电极放入饱和湿度的空气中（用湿润滤纸包裹电极亦可），在“测量值2”处输
10、入标准值98，“当前电压”稳定后，点击“第二点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压2”处。. 电击“自动校正”，系统会自动计算出零位和斜率。5、发酵培养基的配置：用天平称取麸皮320g、12水磷酸氢二钠70.55g、硝酸钾28g、植物油42g，将12水磷酸氢二钠、硝酸钾和植物油用蒸馏水溶于1000ml烧杯中制成营养盐。5.1 培养基摇瓶试验5.1.1 材料4%麸皮： 100ml4%=4g磷酸氢二钠：100ml0.2%=0.2g硝酸钾： 100ml0.2%=0.2g5.1.2 方法 将上述药品装入250mL的三角瓶中，35oC旋转式摇床上（150rpm）培养26小时。判断培养
11、基的粘稠度，如果过于粘稠降低麸皮的含量。5.2 种子的摇瓶 按上述方案配好培养基3份（或2份），进行高温灭菌30min。再将枯草芽孢杆菌种接入摇瓶培养基中，35oC旋转式摇床上（150rpm）培养26小时。6.装料：将配好的营养盐与称好的麸皮从进料口倒入发酵罐，加水（约5升）至淹没温度电极。7、实消：操作步骤与空消类似。区别在于：（1）下位机参数设置如下：灭菌温度： 121.0 灭菌时间： 30min停转温度： 90.0 灭菌转速： 100rpm 结束温度： 37.0 结束转速： 150rpm结束压力： 0.05MPa 结束流量： 30L/min尾气开度： 5% 过程流量：5.00 L/min
12、（2）实消完由于要取样故蒸汽发生装置不可关闭。8.PH电极与DO电极的再次校正（1）DO电极校正：搅拌速度与发酵过程正常转速一致，通气量与发酵过程正常通气量一致，标定溶氧为“100”本实验设定118.3%时为100%溶氧。（2）取样（参比液）：打开取样蒸汽进气阀取下取样口螺盖取样口排出蒸汽关闭夹套蒸汽阀取样口蒸汽排完关闭取样蒸汽进气阀拧松取样阀（开启方向与正常螺旋相反）取样口流出发酵液取样100ml于灭菌锥形瓶（作为参比液存于4冰箱）打开取样蒸汽进气阀取样口排出蒸汽（待冲净取样口）拧上取样口螺盖蒸汽从取样阀排出打开取样蒸汽出气阀拧紧取样阀灭菌10min关闭蒸汽发生装置。（3）测出参比液PH值，以此数值对PH电极校正，本实验测得参比液PH值为7.14，故将下位机此时PH值调为该值。9、接种：当罐温降低至40以下时，采用火圈法接种摇瓶种子。（1）接种前需将20瓶100ml种子液在无菌操作台上混合成两大瓶，以便于接种。（2）用75%酒精擦拭进料口的罐面，
