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1、公猪繁殖力相关基因ADAD1的克隆与分析1、相关定义1.1、植物病程相关蛋白的定义及分类 Van Loon 等人在 1970 年首次在烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus, TMV)侵染 的烟草叶片中检测到与过敏性反应(hypersensitive reaction, HR)相关的蛋白,当时 称之为 b 蛋白,10 年后将其命名为病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PRP/PRs)。PRP 是指植物在病理或病理相关的环境下诱导产生的一类蛋白。1989 年 在西班牙召开的植物病程相关蛋白研讨会提出”病理或病理相关的环境”是指胁迫环 境或逆
2、境,如某些病原物(真菌、细菌、病毒和类病毒)的侵染、某些化学制剂应用 等。在植物自然衰老期间合成的相关酶也都属于病程相关蛋白12。PRP 不仅在被侵 2 染组织中诱导表达,而且在未侵染组织中也有表达,与系统获得性抗性有关,是植物 产生 SAR 的一个显著标志13。 PRP 最初根据蛋白质寄主来源和在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率为标准分类, 随着对 PRP 基因组的分离、克隆、表达的研究不断深入,形成了按氨基酸序列同源 性、血清学关系、电泳迁移率(分子量)和植物来源为标准的分类体系14-16,已发现 的 PRP 被分为 17 个家族,即 PR1 到 PR1717-19,PRP 的类型及特性见表
3、1。 表 1 植物病程相关蛋白家族12 Table 1 The family of plant pathogenesis-related proteins 类型 类型代表蛋白 特征 基因特性 Family Type number Properties Gene symbols PR-1 烟草 PR-1a 抗真菌活性 Ypr1 PR-2 烟草 PR-2 -1,3-葡聚糖酶 Ypr2 PR-3 烟草 P, Q 几丁质酶 class, Ypr3,Chia PR-4 烟草 R 几丁质连接蛋白 class, Ypr4,Chid PR-5 烟草 S 类甜味蛋白 Ypr5 PR-6 马铃薯 Inhibito
4、r 蛋白酶抑制剂 Ypr6,Pis(Pin) PR-7 马铃薯 P69 内源蛋白酶 Ypr7 PR-8 黄瓜几丁质酶 几丁质酶 class Ypr8,Chib PR-9 烟草木质素形成过氧化物酶 过氧化物酶 Ypr9,Prx PR-10 欧芹 PR1 类核糖核酸酶 Ypr10 PR-11 烟草 class V 几丁质酶 几丁质酶,class Ypr11,Chic PR-12 萝卜 RsAFP3 防卫素 Ypr12 PR-13 拟南芥 THI2.1 硫堇 Ypr13,Thi PR-14 大麦 LTP4 脂质转移蛋白 Ypr14,Ltp PR-15 大麦 OxOa(胚) 草酸氧化酶 Ypr15 P
5、R-16 大麦 OxOLP 类草酸氧化酶 Ypr16 PR-17 烟草 PRp27 未知 Ypr17 1.2、EST的概念和技术原理 EST是指从cDNA文库中随机挑取克隆,对其进行一轮大规模测序所获得的部分 cDNA的5或3端序列,长度一般为1 00一5()obp。EST作为基因的”窗口”,可以代表生 物体某种组织某一时间的一个表达基因,所以被称为”表达序列标签,。截至到2007 年5月18日,NCBI的EST数据库中已经收录43,259,126条EST,其中猪的EST 有646,392条(http:/ www.nebi.nlm.nih.g()v/dbEsT/dbEsT一umma以html)
6、EsT的技 术原理:一个典型的真核生物分子由5气UTR(5非翻译区),ORF(开放阅读框架), 3一uTR(3非翻译区)和polyA四部分组成。其cDNA具有对应的结构。对于任何 一个基因,其5忆UTR和3气UTR都是特定的,即每条cDNA的5或者3端的有限序 列即可特异性地代表生物体某种组织某个时期的一个表达基因。来自某一组织的足 够数量的EST即可代表某组织中的基因的表达情况。多数情况下,某组织的总体EST 中的某一种cDNA的测量次数可以代表它在该组织中的表达丰度(于凤池,2005)。 White JA等(2000)将这种以cDNA测序来估计基因表达水平的方法称为”电子 northern
7、,或者”数字northem,。具体方法是首先从组织细胞中提取总mRNA,构建成 标准cDNA文库,然后从中挑选大量克隆,利用载体通用引物测插入载体的CDNA 片段5或者3端300一500的碱基序列。将测序所得的EST与dbEST等数据库中的数 据进行比较分析,根据核酸或蛋白质序列的同源性比较,可以鉴定出哪些EST代表 己知基因,哪些代表未知基因,并对所得的EST进行基因表达丰度分析。 华中农业大学2008届硕士学位论文 1.2.2应用EST分离新基因 由于EST反映的是基因的编码部分,可以直接获得基因表达的信息,而且利用 EST代替基因组测序费用低效率高,因此用EST分离基因具有明显的优越性。
8、采用 EST分离基因的策略通常是基于EST数据库由一个已知的基因利用一些软件寻找同 一种属或不同种属同源基因的EST或同一基因的不同剪切形式,主要有以下几步: (l)对已知部分序列做数据库分析,筛选出代表新基因的EST及相应重叠群与定位 信息,并设计引物; (2)采用PCR方法扩增基因组DNA或cDNA获得部分序列; (3)对扩增产物进行测序,并与已知其生理生化功能的基因序列进行同源性比较, 予以鉴定(Capone,1996)。具体步骤如图l一1: 度丽蔽灭丽瓦两而藉马乏亲缘关系相近的物种脚毛DNAI 在EST数据库中进行BLAST检索 标准:长度=100bp,同源性=90% 获得同源的EST
9、 在nr数据库中进行BLAST分析,除 去代表己知基因的EST 直到不能延伸 根据重叠群设计引 物,PCR扩增基因组 得得到新的EST TT 构构建重叠群 群 获获取部分基因组信息 息 息获得编码区全长长 目目的基因的染色体定位位 位目的基因的SNP检测 测 目目的基因的组织表达谱研究究 RTPCR或 RACE 图1一1应用EST分离新基因的流程图 Figl一1 Sehematic flow ehart of isolation of new genes using EST 1.3、转座子的概念 转座子(transposon)又称跳跃因子,是染色体中一段可以移动的 DNA 序列,它可以通过 切
10、割、重新整合等一系列过程从染色体的一个位置”跳跃”到另一个位置,也可以从一个染 色体跳到另一个染色体,从而使插入位点的基因功能失活,形成突变105。1951 年 Barbara McClintock106在玉米中首先发现了 DNA 转座子,但是,直到 1967 年在大肠杆菌的半乳糖 操纵子研究中发现插入序列这类转座因子后,转座子的概念才被普遍承认和接受。1984 年 Shepherd107等在玉米中又发现了另一类转座子反转录转座子(Retrotransposon)。大量研究 14 证实了转座子在矮牵牛、金鱼草、飞燕草、甜豌豆等植物以及一些多细胞绿藻中广泛存在 108-109。目前至少在 32
11、种植物上发现有转座因子存在,其中研究最多的是玉米、金鱼草、 拟南芥等。 1.4、caspase 家族的定义及分类 到目前为止,在哺乳动物中已被证实的 caspase 家族的成员共有 15 种,按发现的先后顺序可将 其命名为 caspase 1caspase 15。人类中已发现了 11 种30,为 caspase 110, 13;caspase 11, 12 和 14 是在小鼠中发现的, 其中 caspase 11,12 仅存于小鼠中并具种属特异性。Eckhart31等(2005) 在猪,狗 和牛中新发现了 caspase 15,由于人类和小鼠中缺乏这种酶,因此其属于该家族中的一个变异分子。 c
12、aspase 为半胱氨酸蛋白酶家族中的一员,具有天冬氨酸(Asp)底物专一性的特征,是动物 PCD 过 程的关键调控因子。caspase 的激活过程主要包括:1.切下羧基端的小亚基 2.N 端的 prodomain 与大 亚基分离 3.大亚基和小亚基聚合成一个具有活性的四聚体(两个小亚基在中间,两个大亚基位于外 周),形成一个具有活性的 caspase 酶(图 1-3)。 注:红色箭头表示蛋白水解位点。红色圆圈表示的催化位点 Note:Red arrows indicate proteolytic sites. Red circle indicates the catalytic sites.
13、 图 1-3 细胞凋亡中 caspases 的激活32 Fig.1-3 Activation of caspases in apoptosis caspase 家族的第一个成员是 Yuan33等(1993 年)在线虫(C . elegans)中发现的,并将其命名为 3 CED-3,研究发现该基因的过表达会引起细胞凋亡的产生,推测其可能与哺乳动物的 ICE 同源。 Mundle34等发现 ICE 参与到细胞凋亡的级联反应中。后来有学者将其重新命名为 caspase 1。这是 caspase 家族的第一个成员,结构域分析发现其包含 2 个大亚基和 2 个小亚基,它在细胞凋亡中的作 用并不十分明显,
14、而在炎症反应中起到关键作用26,主要参与到 IL- 1的成熟和转运。该家族成员 按功能可分为三类,第一类与炎症相关(inflammatory mediator),包括 caspase 1、4、5 和 11-14;第 二类为启动凋亡(Apoptosis activator),包括 caspase 2、8、9 和 10;第三类为效应凋亡(Apoptosis executioner) ,包括 caspase 3、6 和 735。其中 caspase 15 属于新发现的成员,其具体功能还有待进 一步研究。根据其前体结构域的不同,又可将其分为以下四类,第一类包含两个 DED(death effector
15、 domain)结构域,代表成员为 caspase 8 和 10;第二类包含一个 CARD(caspase recruitment domain)结 构域(大于 90 个氨基酸),代表成员是 caspase 2 和 9;第三类也包含一个 CARD 结构域,代表成员 是 caspase 1、4、5 和 13;第四类它们的 N 端前体很短,一般只有 20-30 个氨基酸,代表成员包 括 caspase 3、6 和 936。结合功能和结构域的初步分类标准,可将该家族成员进一步进行分类。 Uren37等(2000 年)通过结构域特征分析,又发现了与该家族相关的两个新型家族,并命名为 Paracaspa
16、ses 和 metacaspases。其中 Paracaspases 是在后生动物及细菌中发现的,metacaspases 则是在 原生动物及植物和真菌。其中 Paracaspases 的前体结构域编码一个包含 DD (death domain)和一到两 个 Ig 的结构域;而 Metacaspases 又分为 type和 type,type在植物和真菌中被发现,其前体结 构域编码一个脯氨酸重复序 (proline-rich repeat motif)或锌指结构域(zinc finger motif)38;在植物中 发现的 type没有前体结构域,但有大约 200 个氨基酸连接在 p20 与 p10 亚基相连。 1.5、光合作用概念 绿色高等植物的光合作用是指植物利用吸收的光能将 CO2和 H2O 转变成为 淀粉等有机物储存起来并释放氧气的过程,这是一个复杂的能量转移与物质转化 的
