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1、1 动物细胞培养的发展史2 动物细胞的特征3 培养基4 动物细胞的获得与保存5 动物细胞培养方法6 动物细胞培养生物反应器7 动物细胞培养过程参数的控制与检测 动物细胞培养 动物细胞培养的发展史 1 动物细胞培养技术的建立1907年 Harrison首先培养了蛙胚神经管区细胞 并观察到从中长出的轴突细胞 神经纤维 他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志 1911年 Carrel发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用 并首次把无菌技术引入组织培养技术中 1914年 Thomson建立了器官培养技术 1940年 1951年 Earle和Gay分别建立了c3H小鼠结缔组织细胞系的L系和人体细胞系
2、 人体宫颈癌Hela细胞系 动物细胞培养的发展史 2 细胞融合现象的发现19世纪30年代 Muller Schwann Virchow等相继在肺结核 天花 水痘 麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象 1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在 1855年 1858年 科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞 1859年 A Barli在研究黏虫的生活史时发现 某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况 据此 他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的 至此 自然界中广泛存在着多核细胞的事实 才被生命科学工作者接受 动物细胞培养的发展史 3 细胞融合技术
3、的建立和杂交瘤技术的诞生1958年 Okada发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合 60年代 Harris 1965 诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活 1975年 免疫学家Kohler和Milstein利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 选择到能分泌单一抗体的杂种细胞 该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力 并能长期地分泌单克隆抗体 从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术 动物细胞培养的发展史 4 动物克隆技术的建立首例克隆动物成功的报道是在1962年 英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵 经紫外
4、线照射杀死卵细胞核 中 约有1 的重组卵发育成为成熟蛙 这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径 其贡献在于 实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息 并能在一定的条件下发育成动物个体 从而证明了动物细胞仍然具有全能性 初步建立了体细胞核移植的实验体系 证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期 卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用 其作用因子可能是细胞质中的mRNA与有关的蛋白质 动物细胞的特征 1 结构特征 与微生物相比 动物细胞体积较大 对环境因素敏感 营养需求高 倍增时间长 没有细胞壁但对损伤更敏感 动物细胞的特征 细胞膜 动物细胞的特征 2 动物细胞的
5、代谢特征在其培养过程中 葡萄糖和谷氨酸为主要营养物质 乳酸和氨是主要的代谢副产物 葡萄糖的代谢途径在人体内 葡萄糖代谢除了无氧酵解途径以外还有很多其他方式 比如有氧氧化 磷酸戊糖途径 糖原的合成与分解途径 糖异生 糖醛酸途径等 一 糖的有氧氧化途径 1 概念 葡萄糖在有氧条件下彻底氧化成水和二氧化碳的过程2 过程有氧氧化可分为两个阶段 第一阶段 胞液反应阶段 从葡萄糖到丙酮酸 反应过程同糖酵解 糖酵解产物NADH不用于还原丙酮酸生成乳酸 二者进入线粒体氧化 第二阶段 线粒体中的反应阶段 1 丙酮酸经丙酮酸脱氢酶复合体氧化脱羧生成乙酰CoA 是关键性的不可逆反应 其特征是丙酮酸氧化释放的能量以高
6、能硫酯键的形式储存于乙酰CoA中 这是进入三羧酸循环的开端 动物细胞的特征 2 三羧酸循环 三羧酸循环是在线粒体内进行的一系列酶促连续反应 从乙酰CoA和草酰乙酸缩合成柠檬酸到草酰乙酸的再生 构成一次循环过程 其间共进行四次脱氢 脱下的4对氢 经氧化磷酸化生成H20和ATP 2次脱羧产生2分CO2 三羧酸循环的特点是 从柠檬酸的合成到 酮戊二酸的氧化阶段为不可逆反应 故整个循环是不可逆的 在循环转运时 其中每一成分既无净分解 也无净合成 但如移去或增加某一成分 则将影响循环速度 三羧酸循环氧化乙酰CoA的效率取决于草酰乙酸的浓度 每次循环所产生的NADH和FADH2都可通过与之密切联系的呼吸链
7、进行氧化磷酸化以产生ATP 该循环的限速步骤是异柠檬酸脱氢酶催化的反应 该酶是变构酶 ADP是其激活剂 ATP和NADH是其抑制剂 2 3 氧化磷酸化 线粒体内膜上分布有紧密相连的两种呼吸链 即NADH呼吸链和琥珀酸呼吸链 呼吸链的功能是把代谢物脱下的氢氧化成水 同时产生大量能量以驱动ATP合成 1个分子的葡萄糖彻底氧化为CO2和H2O 可生成36或38个分子的ATP 3 生理意义 有氧氧化是糖氧化提供能量的主要方式 动物细胞的特征 二 磷酸戊糖途径 在胞浆中进行 存在于肝脏 乳腺 红细胞等组织 生理意义 1 提供5 磷酸核糖 用于核苷酸和核酸的生物合成 2 提供NADPH 参与多种代谢反应
8、维持谷胱甘肽的还原状态等 三 糖原的合成分解途径 糖原是动物体内糖的储存形式 是葡萄糖通过 1 4糖苷键和 1 6糖苷键相连而成的具有高度分枝的聚合物 机体摄入的糖大部分转变成脂肪 甘油三酯 后储存于脂肪组织内 只有一小部分以糖原形式储存 糖原主要分为肝糖原和肌糖原 糖原是可以迅速动用的葡萄糖储备 糖原合成酶是糖原合成中的关键酶 受G 6 P等多种因素调控 葡萄糖合成糖原是耗能的过程 合成1分子糖原需要消耗2个ATP 肝脏存在葡萄糖 6 磷酸酶 可使肝糖原分解成葡萄糖补充血糖 肌肉组织无葡萄糖 6 磷酸酶 不能直接分解成葡萄糖 肌糖原分解产能可供肌肉收缩需要 四 糖异生 1 概念 由非糖物质转
9、变为葡萄糖的过程称为糖异生 是体内单糖生物合成的唯一途径 肝脏是糖异生的主要器官 长期饥饿 酸中毒时肾脏的异生作用增强 2 过程 糖异生的途径基本上是糖酵解的逆向过程 但不是完全可逆过程 酵解过程中三个关键酶催化的反应是不可逆的 故需通过糖异生的4个关键酶 葡萄糖 6 磷酸酶 果糖 1 6 二磷酸酶 丙酮酸羧化酶 磷酸烯醇式丙酮酸激酶 绕过糖酵解的三个能障生成葡萄糖 3 生理意义 补充血糖 维持血糖水平恒定 防止乳酸中毒 协助氨基酸代谢 动物细胞的特征 五 糖醛酸途径 生理意义 生成有活性的葡萄糖醛酸 它是生物转化中重要的结合剂 葡萄糖醛酸还是蛋白聚糖的重要组成成分 如硫酸软骨素 透明质酸 肝
10、素等 动物细胞的特征 细胞内两个主要的谷氨酰胺代谢酶是谷氨酰胺分解酶和谷氨酰胺合成酶 前者将谷氨酰胺分解成谷氨酸和氨 后者将谷氨酸和氨合成谷氨酰胺 人体不同组织有不同的反应方向 例如 在肌肉 肝脏 大脑 肺和脂肪细胞 谷氨酰胺的合成反应占明显优势 而在肠细胞和免疫细胞 淋巴细胞和巨嗜细胞 内 谷氨酰胺则被大量用来提供细胞能量和供应细胞内DNA和RNA的合成 培养基 动物细胞培养必需的溶液平衡盐水 BSS Hanks液和Earle液是常用的BSS基础溶液 PH调整液 3 7 5 6 7 4 的NaHCO3溶液 HEPES溶液 二羟乙基哌嗪乙烷磺酸 细胞消化液 胰蛋白酶溶液 EDTA溶液 胶原酶溶
11、液 抗生素溶液 1 青 链霉素 每毫升培养液含100U青霉素和100ug链霉素 2 卡那霉素 终浓度为50ug ml培养液 3 制霉菌素 浓度25U ml 小瓶分装 每瓶一次用完 常用的动物血清主要有牛血清和马血清 牛血清分为胎牛血清和犊牛血清 前者来源少 价格高 后者要求刚产下尚未哺乳的小牛 因为哺乳后的小牛血清中可能含有更复杂的成分 血清中已知的成分主要有蛋白质 氨基酸 葡萄糖 激素等 蛋白质主要是白蛋白和球蛋白 氨基酸是细胞合成蛋白质的基本成分 氨基酸中有12种是细胞本身不合成的 必须由培养液提供 激素有胰岛素 生长激素和多种生长因子如表皮生长因子 成纤维细胞生长因子 增殖刺激因子 MS
12、A 类胰岛素生长因子 IGFl IGF2 等 水解乳蛋白 胶原是另外两种较好的天然培养基成分 水解乳蛋白是乳白蛋白的水解产物 呈蛋黄色粉末状 富含氨基酸 一般配制成0 5 溶液 微酸性 胶原是从动物真皮中提取的 具改善细胞表面特性促使其附着生长的作用 培养基 1 天然培养基 天然培养基主要取自动物体液或从动物组织分离提取 其优点是营养成分丰富 培养效果良好 缺点是成分复杂 来源受限 天然培养基 液的种类很多 包括生物性液体 如血清 组织浸液 如胚胎浸液 凝固剂 如血浆 等 天然培养基的特点及存在的问题 组织培养技术建立的早期 体外培养细胞都是利用天然培养基 如蛋白水解物 血清等 其优点是含有丰
13、富的营养物质及各种细胞生长因子 激素类物质 渗透压 pH等也与体内环境相似 缺点是其为成分不明确的混合物 受其来源及法规等问题的限制 制作过程复杂 批次间差异大 并逐渐被合成培养基所取代 实际工作中往往将天然培养基与人工合成培养基结合使用 目前常见有水解乳蛋白和新生牛血清 一般的天然培养基都是属于不完全培养基 培养基 2 合成培养基 1951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基 MEM 合成培养基的种类相当多 合成培养基成分已知 便于对实验条件的控制 但与天然培养基相比 有些天然的未知成分尚无法用已知的化学成分所替代 因此 细胞培养中使用的基础合成培养基还必须加入一定量的天然培养基成
14、分 以克服合成培养基的不足 最普遍的作法是加入小牛血清 动物血清成分复杂 各种生物大小分子混合在一起 有些成分至今尚未搞清楚 血清对细胞生长很有效 但后期对培养产物的分离 提纯以及检测造会成一定困难 另外高质量的动物血清来源有限 成本高 限制了它的大量使用 无血清培养基不加动物血清 在基础培养基中加入细胞生长有效因子 激素等 培养基 成分 1细胞培养基组成及作用氨基酸组成蛋白质的基本单位 不同种类的细胞对氨基酸的要求各异 但有几种氨基酸细胞自身不能合成 必须依靠培养液提供 这几种氨基酸称为必需氨基酸 其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸 在缺少谷氨酰胺时 细胞生长不良而死亡 1 必需
15、氨基酸包括L 谷氨酰胺 L 组氨酸 L 异亮氨酸 L 亮氨酸 L 赖氨酸 L 蛋氨酸 L 苯丙氨酸 L 苏氨酸 L 色氨酸 L 缬氨酸等 维生素维持细胞生长的生物活性物质 在细胞代谢中起调节及控制作用 在细胞培养中 尽管血清是维生素重要来源 但是许多培养基中添加了各种维生素以适合更多的细胞系生长 脂溶性维生素如 A D E K 水溶性维生素如 B1 B2 B6 B12 泛酸 叶酸 生物素 C 烟酰胺等 培养基 许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分 没有它们 酶便没有活性 代谢活动将无法进行 VA是细胞合成糖蛋白时寡糖基的载体 对上皮细胞有重要的维护作用 VD参与调节钙的吸收 VE是抗氧剂
16、可防止组成生物膜的磷脂中不饱和脂肪酸被氧化 VK缺乏会引起低凝血酶原及凝血时间延长 叶酸是合成四氢叶酸的重要原料 四氢叶酸在核酸的生物合成和蛋白质的生物合成过程中起重要作用 生物素是一些特异羧化酶的组成部分 参与糖代谢和脂肪酸的合成过程 碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源 其中有的是合成蛋白质和核酸的成分 主要有葡萄糖 核糖 脱氧核糖 丙酮酸钠和醋酸等 培养基 无机离子钠 钾 镁 钙 磷等基本的无机离子 这些都是细胞组成所必须并参与细胞的代谢 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡 此外 通过提供钠 钾和钙离子 帮助细胞调节细胞膜功能 培养液的渗透压是一个非常重要的因素 细胞通常可耐受260mOsm kg 320mOsm kg 标准培养液的渗透压在此范围内波动 特别注意 向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压 特别是溶于强酸或强碱中的物质 Na 是细胞外液中最主要的阳离子 对维持渗透压的恒定有决定性的作用 K 主要分布在细胞内液 细胞内K 的对于激活某些酶是必需的 它在调节细胞内环境的酸碱平衡也有极重要意义 Ca2 在细胞外液中的作用是将组织内部细胞之间
