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1、第12章核酸通论 1869年Miescher博士论文工作中测定淋巴细胞蛋白质组成时 发现了不溶于稀酸和盐溶液的沉淀物 并在所有细胞的核里都找到了此物质 故命名核质 Nuclein 一 核酸研究简史 1879年Kossel经过10年的努力 搞清楚核质中有四种不同的组成部分 A T C和G 1889年Altman建议将核质改名为 核酸 并且已经认识到 核质 乃 核酸 与蛋白质的复合体 1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验 证明DNA是遗传物质 1952年Hershey Chase的噬菌体感染实验进一步证明DNA是遗传物质 1950年Chargaff E和Hotchkis
2、s R D 采用纸层析法仔细分析了DNA的组成成分 得知 A T G C A G C T 1953年Watson Crick根据DNA的X射线图谱的研究结果 提出了DNA的双螺旋模型 Doublehelix 几星期后提出了半保留式复制模型 1957年MeselsonStahl用密度梯度超离心法 证实半保留复制假说 1958年Kornberg得到高纯度的DNApolymerase 这种酶需要一个模板DNA 1960年Cairns拍摄了复制中的细菌DNA的电镜照片 1970年发现第一个DNA限制性内切酶 1972年建立DNA重组技术 1978年建立DNA的双脱氧测序法 1990年开始实施人类基因组
3、计划 2003年人类基因组计划宣告完成测序任务 二 核酸的生物功能 一 DNA是主要的遗传物质 1928年Griffith的细菌转化实验 1944年Avery重做1928年Griffith的细菌转化实验 证明DNA是遗传物质 但人们对此持怀疑态度 理由是 1 因认为蛋白相对分子质量大 结构复杂 二十种氨基酸的排列组合将是个天文数字 可作为一种遗传信息 而DNA相对分子质量小 只含4种不同的碱基 人们一度认为不同种的有机体的核酸只有微小的差异 2 认为转化实验中DNA并未能提得很纯 还附有其它物质 3 即使转化因子确实是DNA 但也可能DNA只是对荚膜形成起着直接的化学效应 而不是充当遗传信息的
4、载体 1952年HersheyandChase的实验进一步证明DNA是遗传物质 二 DNA和基因组1 DNA和基因组DNA分子中最小的功能单位称作基因 为RNA或蛋白质编码的基因称结构基因 只有调节功能 不转录生成RNA的称调节基因 某生物体所含的全部基因称该生物体的基因组 2 原核生物基因组的特点通常只有一个DNA分子 无重复序列 功能相关的基因常构成一个转录单位 有重叠基因 3 真核生物基因组的特点 1 有重复序列 中度重复序列可重复几十次到几千次 如rRNA基因 tRNA基因和某些蛋白质的基因 高度重复序列可重复数百万次 如卫星DNA和微卫星DNA 2 有断裂基因 不少基因含有称作内含子
5、的非编码区 编码区称作外显子 有些基因可含有几十个内含子 鸡卵清蛋白的基因 人类基因组序列的类型 长分散元件 6 8kb 约85万个 短分散元件 0 1 0 3kb 约150万个 其中Alu元件超过100万个 简单序列重复 大片段重复 二 RNA功能的多样性1 某些病毒的遗传物质 2 控制蛋白质的合成 3 遗传信息的加工 4 基因表达和细胞功能的调控 5 催化功能 6 在细胞分化和个体发育中发挥重要作用 7 在生命起源中可能有重要作用 基本要求1 熟悉核酸的发现和研究简史 2 掌握核酸的种类 分布和生物功能 重点 第13章核酸的结构 一 核苷酸核酸可以水解成核苷酸 核苷酸可以水解成磷酸和核苷
6、核苷可以水解成戊糖和碱基 碱基可以分成多种类型 一 碱基 与氨基酸一样 碱基在细胞中也受到各种各样的修饰 其产物常常扮演信号传导信使分子 营养因子 辅酶等角色 并对核酸结构的稳定性起着重要作用 内酰胺 内酰亚胺 二 核苷 三 核苷酸 二 核酸的共价结构 一 核酸中核苷酸的连接方式 核酸的一级结构 碱基的排列顺序DNA5 ATGCATGC 3 3 TACGTACG 3 RNA5 AUGCAUGC 3 核酸的二级结构 形成双螺旋和单链环核酸的三级结构 空间构象 核酸的结构层次 二 DNA的一级结构 三 RNA的一级结构 ACTG 三 DNA的高级结构 一 DNA碱基组成的Chargaff规则 见表
7、13 5 二 DNA的二级结构依据 Chargaff规则 X衍射图 碱基不可滴定 要点 1 两条链反向平行 绕同一轴相互缠绕成右手螺旋 2 磷酸和戊糖交替处于螺旋外围 碱基处于内部 形成碱基对 3 双螺旋的直径为2nm 碱基堆积距离为0 34nm 4 一条链的核苷酸序列可以决定另一条互补链的核苷酸序列 Watson Crick的DNA双螺旋 双螺旋分子中糖分子与纵轴平行 与碱基平面垂直 稳定双螺旋结构的作用力为氢键 碱基堆积力 即疏水作用 和环境中正离子的作用 碱基的配对使得双螺旋DNA分子在复制时以半保留的形式进行 5 DNA双螺旋分子结构的不同类型 主要有三种 分别命名为A B和C型 其中
8、B型与Watson Crick提出的模型一致 A和C型在低相对湿度的条件下形成 它们的螺距都比B型要短 A型DNA的结构与DNA和RNA的杂合链相似 Z型DNA首先在富含GC的DNA短片段中发现 后用抗体证明天然DNA中也有 它是一种左手螺旋 在细胞中可能与基因表达的调控有关 螺距残基数碱基倾斜A型 75 Na 2 81120 B型 92 Na 3 4100 C型 66 Li 3 19 36 D Rhybrid2 81120 Z型4 6129 Z DNA的结构特点 1 糖磷骨架呈 之 字形 Zigzag 走向 2 左旋 3 G的糖苷键呈顺式 Syn 使G残基位于分子表面 4 大沟消失 小沟窄而
9、深 5 每个螺旋有12bp Z DNA存在的条件 1 高盐 NaCl 2Mol L MgCl2 0 7Mol L 2 Pu Py相间排列 3 在活细胞中如果有m5C 则无需嘌呤 嘧啶相间排列 在生理盐水的浓度下可产生Z型将结构 4 在体内多胺化合物 如精胺和亚胺及亚精胺等阳离子 可和磷酸基因结合 使B DNA转变成Z DNA 5 某些蛋白质如Z DNA结合蛋白带有正电荷 可使DNA周围形成局部的高盐浓度微环境 6 负超螺旋的存在 Z DNA的生物学意义 1 可能提供某些调节蛋白的识别位点 啮齿类动物病毒的复制起始部位有d GC 有交替顺序的存在 在SV40的增强子中有三段8bp的Z DNA存在
10、 2 原生动物纤毛虫 有大 小两个核 大核有转录活性 小核与繁殖有关 Z DNA抗体以萤光标记后 显示仅和大核DNA结合 而不和小核的DNA结合 说明大核DNA有Z DNA的存在 可能和转录调控有关 6 DNA分子的三螺旋结构和单链结构 在DNA分子中 镜像重复序列可以回折 形成三螺旋结构 在某些病毒中 DNA分子以单链形式存在 正螺旋和负螺旋 负超螺旋右旋 正超螺旋左旋 DNA双螺旋为右手螺旋 细胞中的环状DNA一般呈负超螺旋 即右手螺旋不足导致部分碱基不能形成配对 分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右手螺旋的不足 在数学上呈1 1 即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足 正超螺旋为双螺旋旋
11、转过度 通过分子整体的左旋来解开过度的螺旋 三 DNA的三级结构 White方程 L T WL Linkingnnmber 连环数或称拓扑环绕数 指cccDNA中一条链绕另一条链的总次数 其特点是 1 L是整数 2 在cccDNA中任何拓扑学状态中其值保持不变 3 右手螺旋的L取正值 W Writhingnumber 扭曲数 即超螺旋数 其特点是 1 可以是非整数 2 是变量 3 右手超螺旋的W取负值 T Twistingnumber 缠绕数 即双螺旋的圈数 其特点是 1 可以是非整数 2 是变量 3 右手螺旋时T为正值 超螺旋的量度可以用超螺旋密度 来表示 L T T在天然DNA中 约为 0
12、 05 大约20个双螺旋有1个超螺旋 促旋酶 拓扑异构酶 的作用方式 四 DNA与蛋白质复合物的结构 平均每200bp的DNA绕核小体左旋1 75转 因此真核生物的DNA分子为正超螺旋 核小体的电镜照片 组蛋白八聚体 a 前面观 b 顶面观 c 沿着染色体纤维长轴的透视图 d DNA与组蛋白空间结构的模式图 a 核小体的结构图 左图为沿核小体轴观察的图示 右图为沿核小体轴垂直方向观察的图示 b 一半核小体的结构图 四 RNA的高级结构 一 tRNA的高级结构 二 rRNA的高级结构 16SrRNA 三 其他RNA的高级结构 基本要求1 掌握核苷酸的结构特点和重要核苷酸的生物学功用 重点 2 掌
13、握核酸的共价结构 重点 3 掌握DNA的二级结构 熟悉DNA的三级结构 重点 4 掌握RNA的二级结构 熟悉RNA的三级结构 重点 作业题第500页第3题 第500页第4题 第500页第5题 第500页第6题 第500页第7题 第500页第10题 第500页第12题 第500页第13题 第500页第14题 第14章核酸的物理化学性质 一 核酸的水解 一 酸水解糖苷键比磷酸酯键更易水解 特别是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键很容易水解 二 碱水解通常用于RNA水解 DNA的碱水解比较困难 三 酶水解 双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶 restrictionenzyme 切断
14、又可以再连接起来 切断的过程不需要能量 而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP 这就是分子克隆和DNA重组技术的基础 DNA与限制性内切酶 大部分限制性内切酶识别的碱基序列为4 6个碱基的palindrome顺序 它们在微生物细胞内发挥iu的是防御外来DNA入侵的国防军的作用 碱基adenine4 15 9 8cytosine4 5 12 2guanine3 2 9 6thymine9 9 13核苷adenosine3 5 12 5deoxyadenosine3 8cytidine4 15 12 5deoxycytidine4 3 13guanosine1 6 9 2deoxyguanosi
15、ne2 5uridine9 2 12 5deoxythymidine9 8 13核苷酸AMP3 7 6 1 dAMP4 4ADP3 9 6 3 CMP4 5 6 3 dCMP4 6GMP2 4 6 1 9 4 dGMP2 9 9 7UMP6 4 9 5 dTMP10 0 二 核酸的酸碱性质碱基配对时碱基一般以酮式存在 而不是醇烯式 碱基中的H原子一般不移动 因此很少有亚氨基团 在中性pH条件下 参与氢键的 NH2基均不带电荷 这是杂环电子共轭以及氢键共同作用的结果 否则双螺旋结构不会稳定 碱基 核苷 核苷酸的pK值 三 核酸的紫外吸收 1OD260DSDNA50 gSSDNA37 gRNA40
16、 g DNA分子的变性 四 核酸的变性 复性及杂交 变性和复性的含义 DNA的变性在紫外吸收上的变化 Tm的定义 影响Tm的因素1 DNA的均一性越高 Tm的温度范围越小 2 G C含量越高 Tm的值越大 当GC的含量上升1 则Tm上升0 4 马默多蒂 Marmur Doty 关系式 Tm 69 3 0 41 G C 或GC Tm 69 3 2 44 3 介质的离子强度较高时 Tm的值较大 4 酸性条件下 核酸容易脱嘌呤 碱性条件下 核酸容易变性 通常加NaOH降低Tm的值 5 尿素 甲酰胺等化学试剂可以降低Tm的值 称作变性剂 SSC溶液 常用于DNA的溶解 二 复性 T1 2 C const DNA浓度与复性时间的关系 影响复性速度的因素1 DNA的片段越大 复性的速度越慢 2 DNA的浓度越高 复性的速度越快 3 DNA的重复序列越多 复性的速度越快 4 溶液的pH过高或过低 复性的速度均会降低 5 适当增高溶液的离子强度 复性的速度会增高 DNA复性与Cot分析 当C C0 1 2时 k 1 C0t1 2 哺乳动物的DNA一般均呈右图的曲线 这是因为它们的基因组DNA中插入了大
