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1、探索双缩脲法检测血清总蛋白方法学评价论文 探索双缩脲法检测血清总蛋白方法学评价论文 导读：HCH2NH2等基团的物质，以及乙二酰乙二胺都有此颜色反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽均有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris1缓冲液和某些氨基 论文双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价摘要： 目的 评价双缩脲法测定血清总蛋白的方法性能。 方法 配制双缩脲试剂，并用所配双缩脲试剂和标准血清蛋白进行批内重复性试验、回收试验、线 性范围测定。结果
2、双缩脲法测定血清总蛋白的批内重复性试验的变异系数CV%为6.42，回收试验平均回收率为109.3%，线性范围测定的R 为0.9877。结 论 双缩脲法测定血清总蛋白的性能不高， 本人测得的批内重复性试验的变异系数CV%偏大，回收率偏高，线性范围一般，或许这是个人操作因数，因为还有 其他同学的结果比较好的。 关键词：双缩脲法；血清总蛋白；方法学评价 双缩脲法测定血清总蛋白至今已经有近100年的历史，其间该方法也得到不 断改进，是目前测定血清总蛋白的常用方法之一。全国临床检验操作规程推 荐Doumas双缩脲配方作为血清总蛋白测定的常规方法 1。方法学评价对于医学 检验专业学生日后在工作中评价检验方
3、法非常重要， 对培养学生逻辑思维和实验 室质量控制具有重要作用。 本文介绍双缩脲法测定血清总蛋白的方法学评价，对 学生练习和掌握方法学评价有重要意义。 双缩脲试剂鉴定蛋白质的原理：双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲 经180 左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 二价铜离子形成紫色络合物， 称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连 接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此，也能在碱性环境中 与二价铜离子结合生成紫红色络合物。此反应不需要加热，被用来定性鉴定蛋白 质。但请注意：
4、凡含有2个以上肽键的物质或含有1个肽键和1个一CSNH2、一 CH2一NH2、一CH20H、一CHOHCH2NH2等基团的物质，以及乙二酰乙二胺都有 此颜色反应。因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽均有双缩脲反应，但有双缩脲 反应的物质不一定都是蛋白质或多肽2。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 而与蛋白质分子量及氨基酸成 分无关，故可用来测定蛋白质含量。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris1缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅 相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。1.仪器与试剂 1.1 仪器 721型分光光度计；水浴箱
5、。 1.2 试剂 牛血清白蛋白； 硫酸铜结晶(CuSO4 5H2O)； 酒石酸钾钠(NaKC4H4O6 4H2O)； 氢氧化钠(NaOH)；碘化钾(KI)；蒸馏水。2.双缩脲的配制 2.1 称取6g NaOH溶于新鲜制备的25 ml蒸馏水中，配成6mol/L氢氧化钠溶 液。 称取0.75 g硫酸铜，2.25 g酒石酸钾 3 4 5 探索双缩脲法检测血清总蛋白方法学评价论文 导读：大。个人加样误差，在一些关键试剂上加样可能有误差。所使用的比色杯经过多次使用，比色杯壁里遗12345 钠，1.25 g碘化钾依次溶解于125 ml蒸馏 水中在搅拌下加人6mol/L氢氧化钠溶液25 ml，用蒸馏水定容至
6、250 ml。配好的 双缩脲试剂应贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存，若 瓶中有黑色沉淀出现则衙重配。2.2 通常加入碘化钾可以防止铜离子自动还原形成一价氧化铜沉淀。在配制 双缩脲试剂过程中，进行两种不同加试剂顺序，如下 顺序1：硫酸铜酒石酸钾钠碘化钾氢氧化钠 顺序2：硫酸铜碘化钾酒石酸钾钠氢氧化钠 这两种顺序的区别是加酒石酸钾钠和加碘化钾的顺序不同，“顺序1”在加 完酒石酸钾钠后溶液是青蓝色的(如图1左)，“顺序2”在加完碘化钾后溶液颜色 是褐色的(如图1右)，但两种顺序在加完所有试剂后，颜色都是相同的，都为深 蓝色，如图2。这两种不同加试剂顺序的配制方法，虽然过程不同
7、，过程中颜色 变化也不同，但最后的结果是相同的。2图 1 (左为先加酒石酸钾钠)图 2 (左为先加酒石酸钾钠)3.批内重复性试验 3.1 材料 待测样品、双缩脲试剂、蒸馏水、721型分光光度计、水浴箱 3.2 方法 3.2.1 取21支试管放试管架，分别标记空白管1支，重复测定管20支，按表1 添加试剂。 表1 加人物(ml) 蒸馏水 待测样品 双缩脲试剂 试剂添加 测定管20 0.06 3试剂空白管 0.06 33.2.2 涡旋混匀后， 37 水浴10分钟， 在波长540nm条件下比色， 空白管调零， 用分光光度计测定各管吸光度。 3.2.3 计算待测样品的标准差S和变异系数CV%值。 3.
8、3 结果 3.3.1 结果记录 试管号 3 4 5 吸光度 0.121 0.131 0.14 0.129 0.139 表 2 20 个测定管的吸光度值 试管号 吸光度 试管号 吸光度 6 0.12 11 0.14 7 0.123 12 0.14 8 0.128 13 0.139 9 0.12 14 0.146 10 0.125 15 0.139 试管号 16 17 18 19 20 吸光度 0.14 0.144 0.139 0.142 0.1393.3.2 批内重复性试验结果处理3计算公式标准差s (x x)2 (n 1)，变异系数 CV % (s x ) 100标准差s=0.0086，变异系
9、数CV%=6.423.4 讨论评价 3.4.1 批内重复性试验测得数据的CV%=6.42，CV%值比较大，超过4.0，说 明测定的精密度比较低。原因可能有以下几点： 实验中使用的分光光度计比较老旧，一直性能不稳定，多位同学使用后都 表示结果不太好。 使用的加样枪很多都老化了，不好用，导致封密性不强，实验误差大。 个人加样误差，在一些关键试剂上加样可能有误差。 所使用的比色杯经过多次使用，比色杯壁里遗 3 4 5 探索双缩脲法检测血清总蛋白方法学评价论文 导读：回收回收样品1回收样品2255025.953.71.0361.0712345 留一些有色物质，影响了测 量结果。3.4.2 通过10位同
10、学结果的比较，如表3，有五位同学的结果小于4，另五个 同学的结果大于4，最大的CV值是本人测得，说明本人的结果比较差，双缩脲法 测定血清总蛋白的精密度不算太好。本人 同学 1 同学 2 同学 3 同学 4 同学 5 同学 6 同学 7 同学 8 同学 9表 3 10 位同学结果的比较 均值 标准差 s 0.1342 0.0086 0.1353 0.0053 0.1207 0.0039 0.1403 0.0048 0.1414 0.0041 0.1499 0.0055 0.1542 0.0085 0.1109 0.0053 0.1461 0.0078 0.1308 0.0066变异系数 CV%
11、6.42 3.94 3.24 3.45 2.89 3.66 5.35 4.81 5.33 5.054.回收试验4.1 回收试验原理4回收试验是反映分析方法准确测定加入样品中已知浓度或量的纯分析物能 力的试验， 是评价方法准确度的有效方法。回收试验可有效反映方法的比例系统 误差，也可反映方法的竞争性干扰。 本实验通过双缩脲法测定蒸馏水中加入的蛋白质的回收率， 判断双缩脲法比 例系统误差的大小，从而评价方法的准确性。 4.2 回收样品制备 基础样品 0.15mL 0.15mL 表4 回收样品 1 0.15mL 0.05mL 0.1mL 回收样品 2 0.15mL 0.1mL 0.05mL 回收样品
12、 3 0.15mL 0.15mL 待测样品 150g/l 蛋白 蒸馏水4.3 蛋白质浓度测定 4.3.1 蛋白质浓度测定的加样，如表5 表5 试剂(mL) 蒸馏水 150g/l 蛋白溶液 样品 双缩脲试剂 空白管 0.06 3 标准管 0.06 3 样品管 0.06 3注：空白管和样品管各做一管，样品管每个样品做 2 管取平均值，共计 1+1+2+2+2+2=10管。 4.3.2 涡旋混匀后， 37 水浴10分钟， 在波长540nm条件下比色， 空白管调零， 用分光光度计测定各管吸光度。 4.4 结果 4.4.1 结果记录 表 6 蛋白质浓度测定的吸光度值 基础管 样品管 1 样品管 2 0.
13、049 0.050 0.100 0.109 0.153 0.169 0.050 0.105 0.161标准管 吸光度 0.310 平均值 0.310样品管 3 0.233 0.229 0.2314.4.2 结果计算5加入浓度(g/L)=150(回收样品中加入的150g/L蛋白溶液体积/0.3) 回收浓度=回收样品测得能浓度基础样品测得浓度 回收率=(回收浓度/加入浓度)100% 表 7 样品回收 回收样品 1 回收样品 2 25 50 25.9 53.7 1.036 1.07 3 4 5 探索双缩脲法检测血清总蛋白方法学评价论文 导读：970.0353.5001.0500.0302.882图3
14、10名同学平均回收率的散点图5.线性范围评价试验65.1线性范围原理使用不同浓度的蛋白标准溶液，测定各自的吸光度，以蛋白浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制剂量反应曲线，计算双缩脲法的线性关系方程及相关系数。5.2试剂和仪器150g/L蛋白溶液；双缩脲试剂；蒸馏水；分光光 4 1.093 0.068 6.219 回收样品 3 75 87.6 1.168加入浓度(g/L) 回收浓度(g/L) 回收率 平均回收率 标准偏差 CV% 4.4.2 回收试验评价一般要求回收率在95%105%， 最为理想的回收率为100%， 本实验测得的平 均回收率为109.3%>105%，根据10名同学平均回
15、收率的比较(如表8，图3是10名 同学平均回收率的散点图），有 5名同学的平均回收率在95%105%之间，另五 名同学的平均回收率不在95%105%之间，说明本人的所测得的结果准确度不 高； 双缩脲法测定血清总蛋白的准确度也不太高。 距离理想的准确度有点距离。平均回收率 标准偏差 CV%1.093 0.068 6.2190.964 0.055 5.653表 8 10 名同学样品回收结果比较 0.925 0.993 1.066 1.090 1.027 0.022 0.016 0.038 0.063 0.023 2.339 1.562 3.573 5.768 2.2711.059 0.052 4.8820.997 0.035 3.5001.050 0.030 2.882图 3 10 名同学平均回收率的散点图5.线性范围评价试验65.1 线性范围原理 使用不同浓度的蛋白标准溶液，测定各自的吸光度，以蛋白浓度为横坐标， 以吸光度为纵坐标作图， 绘制剂量反应曲线，计算双缩脲法的线性关系方程及相 关系数。 5.2 试剂和仪器 150 g/L 蛋白溶液；双缩脲试剂；蒸馏水；分光光度计；水浴箱
