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1、1 实验五一些试剂对四膜虫影响的观察 2 一 实验目的 1 了解生存环境对生命的重要意义 2 比较各种因素对四膜虫细胞的影响 3 二 实验原理 细胞生存需要一定的条件 四膜虫也不例外 其形态比较固定 细胞较大 它的纤毛和伸缩泡及其本身都在不停的运动 一旦条件发生变化 四膜虫所发生的反应马上就可以被观察到 本实验通过一些常见的化学试剂 以不同的浓度对四膜虫进行处理 观察较短时间内细胞所产生的效应 4 1 酸和碱 每种生物对环境的酸碱度都有一定的影响 水生生物 包括四膜虫 和培养的组织细胞更是如此 酸碱度超过一定的限度 对细胞的生存不利 甚至会将其杀死 深海海水的酸碱度约为pH8左右 大面积的淡水
2、水域酸碱度也较稳定 约在pH6 9之间 海洋和湖泊等水域有较强的调节pH的能力 这是由于水域中存在着H2CO3和碳酸盐的缓冲系统 即使局部地区发生了pH的变化 在一定范围内经过一定时间也能通过这一缓冲系统而恢复正常 但是如果环境污染 酸雨 废酸排放 超过了水域的调节能力 水域的pH就要发生变化 生物的生存和发育就要受到影响 酸碱度的改变对生物的生长生殖和活动都能发生影响 例如 绿草履虫 Parameciumbarsaria 在酸性的培养液中 pH6 0 6 3 体长可达120 m 在碱性培养液中 pH7 6 8 0 体长只有86 m 海胆卵在pH6 2的水中不能受精 pH低于4 6时死亡 各种
3、微生物都有其最适酸碱度 酵母和霉菌适宜在微酸性环境中 也有少数可以在强酸或强碱性环境中生存 5 氧化剂可使蛋白质变性 破坏生物膜结构 在浓度较高时能迅速杀死细胞 常用的消毒剂如次氯酸钠 双氧水都是强氧化剂 强氧化剂的杀菌作用 强氧化剂容易同细菌的细胞壁中的脂蛋白或细胞膜中的磷脂质 蛋白质发生化学反应 从而使细菌的细胞壁和细胞膜受到破坏 即所谓的溶菌作用 细胞膜的通透性增加 且氧化剂迅速扩散进入细胞内 氧化了细胞内酶或RNA DNA 从而致死菌原体 巯基乙醇是常用的还原剂 微量巯基乙醇可防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏 巯基试剂在生化反应中有两个用途 一是防止蛋白质或酶等分子
4、中的SH 基氧化成S S 二是某些酶反应中维持体系的还原环境 经常应用的巯基试剂有二硫丁醇类化合物 如二硫苏糖醇DTT 二硫赤酰糖醇DTE 和2 巯基乙醇 谷胱甘肽也经常应用 巯基乙醇有毒 对环境有危害 对水体可造成污染 2 氧化剂和还原剂 6 去垢剂是一些具有亲水的极性基团和疏水的非极性基团的长链分子 非离子型去垢剂如TritonX 100可与脂双层形成混合微团 它们主要与蛋白质疏水部位相互作用 一般不会引起蛋白质变性 而离子型去垢剂与蛋白结合后可改变蛋白质结构 使之变性 尤其是加热后可使蛋白质解离为单体 如十二烷基磺酸钠 SDS 等 3 去垢剂 7 去垢剂能破坏细胞膜结构 造成细胞损伤 功
5、能丧失 甚至引起死亡 非离子型去垢剂通过溶解膜上的脂蛋白和磷脂类化合物等 使细胞膜结构改变 8 4 高渗溶液 渗液压对细胞的影响 水通过细胞膜的运动方向主要决定于细胞外环境的渗透压 在正常情况下细胞外的渗透压与细胞内渗透压处于平衡状态 细胞维持正常的形态与生理功能 高渗液可使细胞失水 引起细胞形态 功能的改变 低渗液可使细胞膨胀 甚至破裂 9 细胞膜具有对物质选择透过的生理功能 脂溶性越高通透性越大 水溶性越高通透性越小 非极性分子比极性容易透过 小分子比大分子容易透过 水分子可通过水通道进出细胞膜 非极性的小分子如O2 CO2 N2可以很快透过脂双层 不带电荷的极性小分子 如尿素 甘油等也可
6、以透过人工脂双层 尽管速度较慢 分子量略大一点的葡萄糖 蔗糖则很难透过 而膜对带电荷的物质如 H Na K Cl HCO3 是高度不通透的 不同分子透过人工脂双层的能力 10 水通道是处于持续开放状态的膜通道蛋白 水分子的转运不需消耗能量 也不受门控机制影响 水分子通过水通道的移动方向完全由膜两侧的渗透压差决定 水分子从渗透压低的一侧向渗透压高的一侧移动 直到两侧渗透压达到平衡 第一个被发现的水通道蛋白APO1 引自http nobelprize org 11 四膜虫为淡水性原生生物 有伸缩泡来调节渗透平衡 耐低渗 但高渗对其有影响 可注意观察在不同浓度蔗糖和NaCl溶液中细胞发生的变化 12
7、 5 有毒物质 叠氮钠 剧毒 可强烈地抑制并阻断线粒体中细胞色素电子运送系统 甲醛 能使蛋白质变性 常作为防腐剂 固定剂使用 13 6 其他物质 DMSO二甲亚砜 是一种溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂 也是一种渗透性保护剂 能够降低细胞冰点 减轻自由基对细胞损害 改变生物膜对电解质 药物 毒物和代谢产物的通透性 研究表明 DMSO存在严重的毒性作用 与蛋白质疏水集团发生作用 导致蛋白质变性 DMSO用的时候要避免其挥发 要准备1 5 的氨水备用 皮肤沾上之后要用大量的水洗以及稀氨水洗涤 14 材料 1 四膜虫培养液一种单细胞原生动物 主要产自淡水 一般呈倒卵形或梨形 具有两个细
8、胞核 可在10倍镜下轻松地观察其细胞形态及运动等方面的变化 2 各种试剂1mol LNaOH 1mol LHCl 1 甲醛 1 TritonX 100 1 SDS 1 次氯酸钠 1 巯基乙醇 1 DMSO 0 25mol L蔗糖 0 15mol LNaCl 蒸馏水 器材 载玻片 盖玻片 显微镜 牙签 二 试剂和器材 15 试剂 本实验涉及试剂较多 且大多为无色透明液体 实验时请注意小离心管表面的标签 以免搞错试剂 并请大家用记号笔分别在离心管闭上做好记号 16 三 实验操作 一 观察正常状态下的四膜虫试剂 四膜虫培养液1 在一干净载玻片上滴加四膜虫培养液10 l 不加盖玻片 在10倍镜下观察四
9、膜虫的形态和运动状态 然后加上盖玻片用40倍镜观察 注意四膜虫纤毛和内部的结构运动 特别是伸缩泡的运动节奏 记录现象 17 二 各种试剂对四膜虫的影响 以NaOH为例 1 取1mol LNaOH的小离心管 标记为A1 和3只空白1 5ml离心管 在空白管外侧用记号笔标记好A0 1 A0 01和A0 001 并用移液枪在空白管中各加入900 l蒸馏水 2 从A1管中准确吸取100 l液体 加入A0 1管中 吹打混匀 再从A0 1管中准确吸取100 l液体 加入A0 01管中 重复操作 直到最后一管 操作过程中不必更换枪头 18 A1 A0 1 A0 01 A0 001 100 l 100 l 1
10、00 l 19 3 取两片干净载玻片 左侧标记为A1 右侧标记为A0 1 另外取两片干净载玻片 左侧标记为A0 01 右侧标记为A0 001 4 用同一枪头 依次从浓度最低的A0 001开始 分别吸取50 l液体 滴加在载玻片上已标记出的相应位置上 不要涂开 20 5 用装有四膜虫培养液的小塑料瓶从浓度最低的A0 001开始 一次在每一50 l的液滴上滴加一滴四膜虫培养液 约20 30 l 马上用牙签将其混匀 直到浓度最高的样 不必更换牙签 6 混合了最后一个样后 立即开始计时 马上将样品在10倍镜下观察 先从浓度高的开始 将各浓度依次观察 记录现象 每组两个同学各观察1张载玻片 21 7 如
11、在观察浓度最高的样品时发现反应太快而无法观察仔细 可做如下处理 另取干净载玻片 先滴加50 l浓度最高的试剂 在其近旁滴加一滴四膜虫培养液 注意勿使两液混合 将载玻片放显微镜下 观察到四膜虫后用牙签将两者混合 立即观察 50 lA1液体 四膜虫 22 后面的试剂可如NaOH一样操作 分别标记如下 23 按表记录观察结果 四 实验记录 24 四 注意事项 1 四膜虫为淡水性原生生物 可承受一定的低渗压 实验时应选择培养约3天的四膜虫培养液 一则细胞数目较多 二则细胞比较新鲜 如培养时间过久 大部分细胞处于衰老期 细胞运动不明显 2 加入去垢剂后四膜虫细胞发生变化非常快 需立即观察 非离子型去垢剂
12、和离子型去垢剂对细胞膜作用的效果有所不同 可进行比较 3 四膜虫的细胞比较大 可在低倍镜下观察其生理状态 但如没有经过固定染色 应将光线适当调暗 以方便观察 4 如要准确计时 最好准备秒表 25 在实验报告中按自己的观察结果回答下列问题 1 四膜虫更耐酸还是碱 酸和碱何者对四膜虫的破坏大 2 氧化剂和还原剂何者对四膜虫的影响大 3 SDS与TritonX 100两种去垢剂何者作用更强 4 高渗溶液在稀释后对四膜虫的作用是否如你所预料 5 DMSO在所给的浓度下对四膜虫的作用如何 五 作业 26 五 思考题 1 能够理解渗透压 去垢剂对细胞形态功能上发生的作用和机制 并能够准确地描述所观察到的现象及给出合理的解释 2 为什么溶液中酸碱度可对活细胞产生严重的影响 27 最后 请同学们在实验结束后把桌面整理好 使用过的离心管 盖玻片丢到垃圾桶里 载玻片洗净回收 登记好显微镜使用记录本 经助教检查后再离开
