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1、1 第七章微生物的生长与控制 2 生长 微生物细胞吸收营养物质 进行新陈代谢 当同化作用 异化作用时 生命个体的重量和体积不断增大的过程 繁殖 生命个体生长到一定阶段 通过特定方式产生新的生命个体 即引起生命个体数量增加的生物学过程 发育 从生长到繁殖 是生物的构造和机能从简单到复杂 从量变到质变的发展变化过程 这一过程称为发育 个体生长 微生物细胞个体吸收营养物质 进行新陈代谢 原生质与细胞组分的增加为个体生长 群体生长 群体中个体数目的增加 可以用重量 体积 密度或浓度来衡量 由于微生物的个体极小 所以常用群体生长来反映个体生长的状况 个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 个体生长 个体繁
2、殖 生长与繁殖的概念 3 第一节微生物纯培养分离及生长测定方法 4 一 获得纯培养的方法 纯培养 pureculture 微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代 称纯培养 5 首先将待分离的样品进行连续稀释 目的是得到高度稀释的效果 使一支试管中分配不到一个微生物 如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长 那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物 这种方法适合于细胞较大的微生物 液体稀释法 6 平板划线分离法 StreakPlate 特点 快速 方便 分区划线 适用于浓度较大的样品 连续划线 适用于浓度较小的样品 Aninocula
3、tingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar 7 连续划线 划线分离后平板上显示的菌落照片 8 倾注平板法 PourPlate Organismsareseriallydiluted thenasmallamountisaddedtoanemptysterilepetridish towhichmeltedagarat50 Cisadded Thenmixtodistributetheorganisms 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 9ml 9 平板涂布分离法 SpreadPlate 简单易
4、行 但易造成机械损伤 Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod 10 选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物 可以根据该微生物的特点 包括营养 生理 生长条件等 采用选择培养的方法进行分离 利用选择培养基进行直接分离 富集培养 11 单细胞 单孢子 分离法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法 该方法要在显微镜下进行 毛细管法 用毛细管提取微生物个体 适合于较大微生物 显微操作仪 用显微针 钩 环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养 小液滴
5、法 将经过适当稀释后的样品制成小液滴 在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离 12 MembraneFilter Whenthereisasmallnumberoforganismsinalargeamountofliquid theliquidisfilteredthroughamembraneandthenthemembraneisplacedonagarinapetridish 13 二 微生物纯培养生长的测定方法 描述不同种类 不同生长状态的微生物生长情况 需选用不同的测定指标 一 微生物细胞数目的检测法直接法 血球计数板 比例计数法 间接法 活菌计数法 液体稀释法 膜过
6、滤法 二 微生物生长量和生理指标测定法直接法 干重法 堆体积法 间接法 比浊法 碳 氮含量法 其它生理指标 14 1 血球计数板法 15 原理 将1cm2 0 1mm的薄层空间划分为400小格 从中均匀分布地选取80或100小格 计数其中的细胞数目 换算成单位体积中的细胞数 适用范围 个体较大细胞或颗粒 如血球 酵母菌等 不适用于细菌等个体较小的细胞 因为 1 细菌细胞太小 不易沉降 2 在油镜下看不清网格线 超出油镜工作距离 特点 快速 准确 对酵母菌可同时测定出芽率 或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞 1 血球计数板法 16 2 涂片染色法 应用 可同时计数不同微生物的菌数 适于土壤
7、 牛奶中细菌计数 方法 用镜台测微尺计算出视野面积 取0 1ml菌液涂于1cm2面积上 计数后代入公式 每ml原菌液含菌数 视野中平均菌数 涂布面积 视野面积 100 稀释倍数 17 3 平板菌落计数法 18 3 平板菌落计数法 技术要求 样品充分混匀 操作熟练快速 15 20min完成操作 严格无菌操作 注意事项 每一支吸管只能用于一个稀释度 样品混匀处理 倾注平板时的培养基温度 适用范围 中温 好氧和兼性厌氧 能在营养琼脂上生长的微生物 误差 多次稀释造成的误差是主要来源 其次还有由于样品内菌体分布不均匀 以及不当操作 Astandardplatecount viablecount ref
8、lectsthenumberofviablemicrobesandassumesthateachbacteriumgrowsintoasinglecolony platecountsarereportedasnumberofcolony formingunits CFU perml CFU ml orperg CFU g ofsample 19 Whenweobservecolonies wecannotassumeeacharosefromjustonecelloriginallyplantedonthemedium however Apair chainorclusterofcellswh
9、ich land onthemediumincloseproximitytoeachothercanmultiplyandproduceasinglecolony Thus weusethetermcolony formingunitwhenweconsiderthecommonoriginforthecellsofanycolony ThistermisusuallyabbreviatedCFU Colony FormingUnit 20 4 液体稀释法 10n 10n 2 10n 1 21 5 薄膜过滤计数法 常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目 将定量的样品通过薄膜 硝化纤维素
10、薄膜 醋酸纤维薄膜 过滤 菌体被阻留在滤膜上 取下滤膜进行培养 然后计算菌落数 可求出样品中所含菌数 22 6 干重法 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来 然后烘干 干燥温度可采用105 100 或80 称重 一般干重为湿重的10 20 而一个细菌细胞一般重约10 12 10 13g 该法适合菌浓较高的样品 举例 大肠杆菌一个细胞一般重约10 12 10 13g 液体培养物中细胞浓度达到2 109个 ml时 100ml培养物可得10 90mg干重的细胞 23 7 比浊法 原理是在一定范围内 菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比 即与光密度成正比 菌数越多 光密度越大 因此 借助于分光光度
11、计 在一定波长下测定菌悬液的光密度 就可反应出菌液的浓度 特点 快速 简便 但易受干扰 24 8 生理指标法 测含氮量蛋白质是细胞的主要物质 含量稳定 而氮是蛋白质的主要成分 通过测含氮量就可推知微生物的浓度 一般细菌含氮量为干重的12 5 酵母菌为7 5 霉菌为6 0 根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6 25 就可测得粗蛋白的含量 其他方法含碳 磷 DNA RNA 耗氧量 消耗底物量 产二氧化碳 产酸 产热 粘度等 都可用于生长量的测定 25 Table1 SomeMethodsusedtomeasurebacterialgrowth 26 第二节微生物的生长规律 27 由于微生物细胞极其
12、微小 研究其个体生长存在着技术上的困难 同步生长的概念 一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态 称为同步生长 synchronousgrowth 进行同步分裂的细胞称为同步细胞 同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相 彼此间形态 生化特征都很一致 因而是细胞学 生理学和生物化学等研究的良好材料 一 微生物的个体生长和同步生长 28 获得同步生长的方法 获得同步生长的方法主要有两类 环境条件诱导法 变换温度 光线 培养基等 造成与正常细胞周期不同的周期变化 选择法 选择性过滤 梯度离心 物理方法 随机选择 不影响细胞代谢 29 Helmstetter Cummings法 原理
13、一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上 步骤 菌悬液通过微孔滤膜 细胞吸附其上 反置滤膜 以新鲜培养液通过滤膜 洗掉浮游细胞 除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞 即为同步培养 30 Figure5 Thesynchronousgrowthofabacterialpopulation Bycarefulselectionofcellsthathavejustdivided abacterialpopulationcanbesynchronizedinthebacterialcelldivisioncycle Synchronycanbemaintainedforonlyafew
14、generations Figure synchronousgrowth 31 二 微生物的群体生长 无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌 其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的 由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代 一个世代所需的时间就是代时 enerationtime G 代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需时间 有时也称为倍增时间 右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况 右图可见 每经过一个代时 细胞数目就增加一倍 呈指数增加 因而被称为指数生长 这就是单细胞群体生长的特征 1 无分支单细胞微生物的群体生长特征 32 Bydefinition bacterialgrowt
15、hiscellreplication i e growthoftheculture Mostspeciesofbacteriareplicatebybinaryfission whereonecelldividesinto2cells the2cellsinto4 the4into8 etc Ifthiscelldivisionoccursatasteadyrate suchaswhenthecellshaveadequatenutrientsandcompatiblegrowingconditions wecanplotnumbersofcellsvs timesuchasonthegrap
16、hatright Beforetoolong wewillneedtoextendthepaperverticallyasthepopulationcontinuestodouble Foraculturewherecellsdivideevery20minutes onecellcanresultin16 777 216 i e 224 cellsafterjust8hours barringnutrientdepletionorothergrowth alteringconditions 1 无分支单细胞微生物的群体生长特征 33 Ifweweretoconvertourverticalaxistoalogarithmicscale asonthegraphatright wewillnotneedasmanysheetsofgraphpaper andwewillfindthatasteadyrateofgrowthisreflectedasastraightline Ontheverticalaxis thesamedistanceonthepaperiscoveredwith
