《一种基于人miR-30结构高效敲除LMP1基因的慢病毒载体的构建》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种基于人miR-30结构高效敲除LMP1基因的慢病毒载体的构建（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一种基于人m i R 3 0 结构高效敲除L M P l 基因的慢病毒载体的构建 黄必军 周清明 陈晓倩 张美殷 黄国良 魏蓉蓉 黄龙 王辉云 中山大学肿瘤防治中心实验研究部广州广东5 1 0 0 6 0 幸 通讯作者 背景与目的 与E B V 相关的恶性肿瘤在潜伏感染期大多数都表达E B 病毒 E B V 潜伏膜蛋白1 L M P l 并与肿瘤的发生发展及恶化密切相关 在鼻咽癌 N P C 中L M P l 已被公认为其癌基 因 o n c o g e n e 本研究主要构建慢病毒载体 探讨利用m i R N A 干扰原理进行L M P l 病毒癌基因 的敲除的可行性及有效性 方法 基于人m
2、 i R 一3 0 a 结构 利用靶点分析软件设计四个L M P l 的 候选沉默靶点 并构建R N Ap o lI I 型C M V 启动子下的真核表达载体 报告基因E G F P 与m i R L M P l 靶点形成共顺反子表达 靶点载体质粒与L M P l 高表达质粒用质脂体共转染工具细胞2 9 3 用w e s t e r nb l o t 方法筛选最有效的敲除靶点并用三质粒系统在2 9 3 1 丌细胞中包装慢病毒 纯化浓 缩并进行滴度鉴定 结果 在2 9 3 工具细胞中成功筛选到一个高效敲除L M P l 基因的靶点序列 C C T C A T C C T G C T C A 1
3、3 A q 3 对应于L M P l 基因第三外显子编码区的1 6 8 8 5 3 1 6 8 8 7 I n t G e n b a n k 的V 0 5 5 5 2 数据库 其基于m i R 一3 0 a 结构的m i R L M P l 为 C T C G A G A A G G T A T T I 优T G T r G A C A G T G A G C G A A C C T C A T C C T G C T C A T T A T r G A G T G A A G C C A C A G A T G T A C 从 I A A T G A G C A G G A T G A G
4、 G T C T G C c T A c T G C c I G cAA I I G 在w e s t e r nb l o t 水平的蛋白敲 除率高达9 5 其克隆靶点质粒经测序验证 2 0 1 z g 慢病毒骨架质粒与2 5 I 山g 助手质粒H e l p l 0 及 H e l p e r 2 0 共转染1 2 1 0 7 个2 9 3 1 阿细胞 在2 0 r a l 培养上清中可获得具有活性慢病毒颗粒7 2 1 0 8 个 6 0 个活性慢病毒 2 9 3 F T 细胞 培养上清原液中慢病毒滴度为3 6 1 0 7T U m l 经纯化 浓缩获得重组慢病毒颗粒 滴度高达6 1 0
5、9T U m l 经流式细胞仪检测在8 0M O I 时其感染E B V 阳性的鼻咽癌细胞株C 6 6 6 一l 的感染率高达8 0 以上 结论 基于人m i R 一3 0 a 结构的m i R L M P l 能高效敲除L M P l 基因的蛋白表达 利用慢病毒载体来建立稳定基因沉默肿瘤细胞株可能 是一个良好的方法 慢病毒 L e n t i v i m s 载体是以人类免疫缺陷型病毒 m y 为基础发展起来的基因治疗载 体 它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力 并可以在体内较长期的表达且安全性高 L e n t i v i m s 为 自杀 性病毒 即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞
6、 也不会利用宿主细 胞产生新的病毒颗粒 L e n t i v i r u s 中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代 利用 v s V G 形成衣壳的假病毒 p s e u d o v i m s 安全性处于可控范围 目前已广泛应用于基础研究 及临床试验中 现在全球有1 9 个应用慢病毒载体的临床试验方案正在进行中 但是在实际应用 过程中面临病毒包装困难 特别是病毒滴度低的技术问题难于解决 6 5 基于r a i c r o R N A m i R N A 的R N A i 技术是近年来发展起来的全新基因干扰技术 与R N A i 不 一样的是 基于m i c r o R N A 的
7、R N A i 技术是利用p o lI I 型启动子 而以前R N A i 技术是利用p o ln l 型启动子U 6 或H l 这样干扰的效果更加有效 由于p o lI I 型启动子的转录功能更强大 再者 该表达系统可以与E G F P 报告基因形成共顺反子 p o l y c i s t r o n i c 表达 便于监测m i e r o R N A 的表 达 可应用于动物活体成像研究 同时还可以在p o lI I 型启动子控制下形成多个靶点的共表达 达到一个载体平台携带多个靶点 特别是应用于抗病毒感染时 可以利用m i R N A 的干扰 模 糊 原理 打击因病毒靶点序列突变而带来的脱
8、靶效应 t a r g e t o f fe f f e c t 在本项目中构建基 于人m i R 一3 0 a 结构的m i R L M P I 靶点 并利用外源工具细胞2 9 3 筛选到一个高效干扰L M P l 基 因蛋白表达的靶点序列 应用第三代慢病毒载体包装为重组慢病毒颗粒 获得了高滴度及高效 率转染的慢病毒颗粒 为进一步建立稳定细胞株并进行基因的功能研究奠定了基础 实验材料与方法 研究材料 细胞株 2 9 3 2 9 3 F r C 6 6 6 一l C N E l C N E 2 5 8 F B 9 5 8 剐i 2 9 3 及2 9 3 1 r 培养于含1 0 胎牛血清 H y
9、 c l o n e 的D M E M 培养基 1 2 8 0 0 0 1 7 G I B C O C 6 6 6 1 C N E l C N E 2 5 8 F B 9 5 8 及R e j i 细胞培养于含1 0 胎牛血清的1 6 4 0 培养基 2 4 天进行胰酶消化传代 菌株 大肠杆菌菌株D H 5 a 含1 0 0 u g I I l l 氨卞抗性L B 培养基 用于扩增p L N C X 2 一C M V L M P I 慢病毒载体和辅助包装载体质粒 质粒 L M P l 真核高表达质粒p L N C X 2 一C M V L M P I 克隆B 9 5 8 细胞株E B V 原型
10、毒株 L M P l 基因组大片段基因 重组于H i n d l I I 与C l a I 位点之间 长为1 3 5 5 b p 含三个外显子及两个内 含子 经酶切及测序鉴定 由本实验室保存 慢病毒骨架质粒p p G F P 见图 慢病毒包装 辅助质粒H e l p e d 0 及H e l p e r 2 0 见图 提取 普通质粒抽提试剂盒M i n i p r e pp l a s m i dK i t Q i a g e n 慢病毒包装骨架质粒纯化试剂 盒为高纯度去类毒素的P u r e L i n kH i p u r ep l a s m i dD N Ap u r i f i c
11、a t i o nk i t I n v i t r o g e n 提取质粒D N A 经过紫外分析仪N A N O D R O P1 0 0 0 T h e r m oS c i e n t i f i c 浓度及纯度检测 转染 L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 11 6 6 8 5 0 0 I n v i l T o g e n 一抗 小鼠L M P l 单抗 G M 0 8 9 7 0 2 D A K O 小鼠G A P D H 单抗 一3 2 2 3 3 S a n t a C r u z 二抗 山羊抗小鼠I S G 一2 0 0 5 S a n t
12、a C r u z 显影 E C L p l u s T MW e s t e r nb l o t t i n gs y s t e m 试剂盒进行显色 A m e r s h a m 公司 E B 病毒L M P l 基因在相关细胞中的表达分析 1 R e a lt i m eR T P C R 检测E B 病毒L M P l 基因在相关细胞中的表达 收集生长状态良好的目的细胞 提取R N A 并反转录得到e D N A 并以该e D N A 为模板 用针 对目的基因设计合成的R e a l t i m eP C R 引物进行扩增 以检测细胞中目的基因的表达 总R N A 抽提根据I n
13、v i t r o g e n 公司的T r i z o l 操作说明书进行 R N A 逆转录获e D N A 根据P r o m e g a 公司的M M L V 操作说明书进行 均为R N a s e f r e c 操作 R e a l t i m eP C R 检测 E B V L M P l 引物和A e t i n 引物采用软件B e a c o nd e s i g n e r2 设计 E B V L M P l 一F c C T C A T C C T G C T c A T r A q 3 G 及E B V L M P l 一R A G T C A T C G T G G
14、l G G l r G T r C A c t i n F T C G T G C G T G A C A I I I G G A G 及A e t i n R A A G G T A G T I T C G T G G A T G C C 吉凯基因合 成 用S Y B R 荧光法在R e a lt i m eP C R 仪器 B i o r a d 公司 进行 设定程序为两步法 预变性 6 6 9 5 1 5 S 之后每一步变性9 5 5 S 退火延伸6 0 a C 3 0 S 共进行4 5 个循环 每次在延伸阶 段读取吸光值 制作熔解曲线 P C R 结束后 在9 5 变性l m i n
15、然后冷却至5 5 C 使D N A 双 链充分结合 从5 5 开始到9 5 每一步增加0 5 C 保持3 0 S 同时读取吸光值 将最后的 P C R 产物跑胶 观察P C R 扩增的特异性 2 W e s t e r nb o l t i n g 检测E B 病毒L M P l 基因在细胞中的表达 将L M P l 真核高表达质粒p L N C X 2 一C M V L M P l 用脂质体I i p o f a e t a m i n e 2 0 0 0 转染2 9 3 T 细胞 蛋白样品 与其他细胞2 9 3 T H e l a H 1 2 9 9 5 8 F C 6 6 6 一l C
16、N E C N E 2 总蛋白一起进行 W e s t e r nb o l t i n g 分析检测 参照 分子克隆 相关方法 S D S P A G E 分离胶浓度为1 0 在 4 4 0 0m A 恒流条件下电转1 2 0 m i n 转P V D F 膜并用封闭液 含5 脱脂牛奶的T B S T 溶液 封闭 一抗 小鼠L M P l 单抗 G M 0 8 9 7 0 2 D A K O l 3 0 0 0 稀释 小鼠G A P D H 单抗 一 3 2 2 3 3 S a n t a C r u z l 5 0 0 0 稀释 二抗 山羊抗小鼠I g G s c 一2 0 0 5 S a n t a C r u z 1 5 0 0 0 稀释 显影 E C L p l u s I MW e s t e r nb l o t t i n gs y s t e m 试剂盒迸行显色 A m e r s h a m 公司 基于人m i R 一3 0 a 结构的L M P l 干扰靶点设计 克隆及筛选 设计E B V L M P I 的O R F 的四个候选靶点 h t t p k a t
