《鸡滑液囊支原体感染快速血清凝集试验(RSA)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《鸡滑液囊支原体感染快速血清凝集试验(RSA)（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、DB34 T 3418 2019 5 A A 附 录 A 规范性附录 鸡滑液囊支原体感染快速血清凝集试验 RSA A 1 样品采集 保存与处理 从鸡群采集的血清样品 如不能立即进行试验 应 4 保存 保存期不超过 72 h 不能冻结 鸡 血清在 56 水浴 30 min 后进行检测 A 2 试剂 试验用染色抗原 阳性及阴性对照血清 A 3 操作方法 室温中加一滴 20 uL 血清于白瓷板或玻板上 再加等量染色抗原 用加样枪头将其混合 轻轻摇 动使之充分反应 室温条件下 鸡血清 2 min内 火鸡血清 3 min 内判定结果 试验设阳性血清及阴性血清对照 A 4 结果判定 A 4 1 规定时间内
2、 发生完全凝集的 判为阳性 A 4 2 如仅在液滴边缘部分出现凝集 或超过 2 min 火鸡 3 min 在边缘出现凝集 判为可疑 A 4 3 超过规定时间无凝集者 判为阴性 A 4 4 对判为可疑样品进行重试 如结果符合 C 4 1 判为阳性 如符合 C 4 3 判为阴性 如仍符合 C 4 2 应选其他方法进行重试 DB34 T 3418 2019 6 B B 附 录 B 规范性附录 鸡滑液囊支原体感染血凝抑制试验 HI 检查 B 1 血凝试验 HA 测定 MS 抗原血凝价 B 1 1 试验在 96 孔 V 型微量反应板上进行 B 1 2 试验使用的MS标准抗原和标准阳性对照分装后于 20
3、保存 B 1 3 试验使用的红细胞为新鲜的 0 8 鸡红细胞悬液 B 1 4 常规倍比稀释法测定 MS 抗原的血凝价 以 100 凝集 红细胞呈颗粒性伞状凝集于孔底 的 MS 抗原最大稀释孔为该 MS 抗原血凝价 即 1 个血凝单位 B 2 血凝抑制试验 HI 测定 MG 抗体血凝抑制价 B 2 1 试验在 96 孔 V 型微量反应板上进行 B 2 2 试验使用的 MS 抗原分别含有 4 个血凝单位 B 2 3 试验使用的红细胞为新鲜的 0 8 鸡红细胞悬液 B 2 4 去除待检血清中非特异性血凝因子 按照 1 mL 稀释待检血清 1 5 加 6 8 滴洗涤的鸡红 细胞比例 37 作用 10
4、min 后 除去红细胞 取上清液进行检测 B 3 试验程序 B 3 1 于第 1 孔中加入 PBS 50 L 再取 4 个血凝单位 MG 抗原依次加入 3 8 孔 每孔 50 L 第 2 孔加含有 8个血凝单位的 MS 抗原 50 L B 3 2 吸 1 5 稀释的待检血清 50 L 于第 1 孔中 混匀后吸 50 L 于第 2 孔中 依次倍比稀释 至第 8 孔 最后弃去 50 L B 3 3 置振荡器上振荡 1 min B 3 4 放室温下 18 20 作用 20 min B 3 5 滴加 50 L 0 5 鸡红细胞悬液于各孔中 振荡混合后 室温下静置 30 40 min 判定结果 B 4
5、结果判定 B 4 1 以 100 抑制红细胞凝集的待检血清最大稀释度为该血清 MS 抗体血凝抑制价 B 4 2 血凝抑制价 1 80 以上判为 MS 抗体阳性 1 40 血凝抑制价 1 80 时为结果可疑 21 天后再采血检测 DB34 T 3418 2019 7 C C 附 录 C 规范性附录 鸡滑液囊支原体感染酶联免疫吸附试验 ELISA 检查 C 1 材料和试剂 C 1 1 主要仪器 含 490 nm 波长酶标仪 37 恒温设备 可调微量移液器 C 1 2 主要试剂 C 1 2 1 ELISA 抗原 支原体培养 鸡滑液囊支原体标准株接种支原体液体培养基 36 摇动培养 2 3 d 已明显
6、混浊 的培养液按 8000 r min 离心 20 min 沉淀用 PBS 在相同条件下洗 3 次 上述沉淀用 PBS 悬浮 超声波打碎后上清即为 ELISA 抗原 C 1 2 2 酶结合物 辣根过氧化物酶标记羊或兔抗鸡 IgG 抗体 C 1 2 3 阳性血清 MS抗原免疫 SPF 级鸡只 3 次获得的抗血清 C 1 2 4 阴性血清 无 MS 感染的 SPF 级鸡只血清 C 1 2 5 试剂溶液的配制 C 1 2 5 1 包被液 0 05 mol L pH 9 6 称取碳酸钠 1 59 g 和碳酸氢钠 2 93 g 溶于蒸馏水中并定容至 1000 mL C 1 2 5 2 洗涤液 取入 Tw
7、een 20 0 5 mL 加入到 1000 mL PBS 0 01 mol L pH 7 4 中 充分混匀 C 1 2 5 3 稀释液 含 10 小牛血清的洗涤液 C 1 2 5 4 磷酸盐一柠檬酸缓冲液 pH 5 0 称取柠檬酸 3 26 g 和磷酸氢二钠 Na2HPO 12H20 12 9 g 溶于蒸馏水 并定容至 700 mL C 1 2 5 5 底物溶液 取邻苯二胺 OPD 4 mg 和 30 过氧化氢 2 uL 加入 10 mL 磷酸盐一柠檬酸缓冲液中溶解混匀 DB34 T 3418 2019 8 C 1 2 5 6 终止液 2 mol L 硫酸 硫酸 58 mL 加入到 442
8、mL 蒸馏水中混匀 C 2 酶联免疫吸附试验 ELISA 操作步骤 C 2 1 包被抗原 将最适工作浓度的抗原用包被液稀释 每孔 100 L 置 37 1 h 后再 4 过夜 用洗涤液洗5 次 每次 3 min 拍干 C 2 2 加样 待检血清和阴性 阳性血清分别用稀释液做 1 40 稀释 每孔加入 100 L 37 孵育 1 h 洗涤 同上 C 2 3 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度 每孔加入 100 L 37 孵育 1 h 洗涤同上 C 2 4 加底物溶液 每孔加入新配制的底物溶液 100 L 置 37 避光显色 10 15 min C 2 5 终止反应 每孔加入终止液 50 L C 2 6 测 A 值 在酶标仪上 于 490 nm下测量和记录吸光值 A 490 C 3 结果判定 C 3 1 在阴性和阳性血清对照成立的条件下 进行结果判定 C 3 2 同时符合下列 2 个条件者 判为阳性 a 待检血清的 A 值 0 2 b 待检血清的 A 值 阴性对照血清的 A 值 2 10 C 3 3 均不符合上述 2 个条件者 判为阴性 C 3 4 仅有 1 条符合者 判为可疑 需重试 C 3 5 对判为可疑样品进行重试 如结果符合 C 3 2 判为阳性 如符合 C 3 3 判为阴性 如仍符合 C 3 4 应选其他方法进行重试
