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1、实验七基因片段的亚克隆 DNA的酶切 回收和连接 一 实验目的掌握DNA酶切的基本原理 学习和了解限制性内切酶的使用方法 学习和掌握DNA片段胶回收的方法 二 实验原理1 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定碱基序列的核酸水解酶 它们的功能类似于高等动物的免疫系统 用于抗击外来DNA的侵袭 现已发现几百种限制性内切酶 它们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键 产生的DNA片段5 端为P 3 端为OH 由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割 因而在基因重组 DNA序列分析 基因组甲基化分析 基因物理图谱绘制及分子克隆等技术中收到广泛应用 2 DNA的酶切反应分子
2、生物学中经常使用的是II型限制性内切酶 它能识别双链DNA分子中特定的靶序列 4 8bp 并在该序列内切断DNA 形成特有的粘末端或平端 3 DNA的连接在T4DNA连接酶的作用下 平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上 DNA连接酶的作分三步 T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶 AMP复合物 酶 AMP复合物再结合到具有5 磷酸基和3 羟基切口的DNA分子上 使DNA腺苷化 产生一个新的磷酸二酯键 把缺口封起来 三 试剂与器材 一 试剂限制性内切酶EcoRI HindIII 10 内切酶缓冲液T4DNA连接酶 10 连接酶缓冲液电泳缓冲液 0 5 TBE或1 TAE 琼脂糖 溴酚兰
3、溴化乙锭 工作浓度0 5 g ml 酚 氯仿 无水乙醇 70 乙醇 灭菌双蒸水 Note Concentration 20 000and100 000units ml AssayedonlambdaDNAStorageConditions 250mMNaCl 10mMTris HCl pH7 4 0 1mMEDTA 1mMdithiothreitol 0 5mg mlBSA and50 glycerol Storeat 20 CDiluentCompatibility DiluentBHeatInactivation 65 Cfor20minutesNotsensitivetodam dcmo
4、rmammalianCpGmethylationConditionsoflowionicstrength highenzymeconcentration glycerolconcentration 5 orpH 8 0mayresultinstaractivity 双酶切buffer的选用 二 实验器材1 电泳仪 电泳槽 紫外检测仪 摄影设备2 恒温水浴槽 四 操作步骤酶切反应设计酶切体积为20 30 l 计算清楚酶切系统中各成分的用量 清晰做好记录 如果是同一条件下进行多个酶切反应 建议统一加好共同的组分后 分装 先加入正确体积的无菌双蒸水 加入1 10体积的10 x酶切缓冲液 混匀 在冰浴
5、条件下加入适量的限制性内切酶 加入适量的DNA样品 弹匀 短暂离心 置所用限制性内切酶最适温度水浴中 酶切1 3小时 酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积 以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大 置65 水浴中10分钟 对限制性内切酶进行灭活 不同的酶灭活条件可能不同 请参照说明书进行 进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果 反应体系 10 内切酶缓冲液2 lDNA1 1 5 g限制性内切酶2 5单位用灭菌的ddH2O补至20 l 37 1小时 可根据需要按比例放大 pGFPuv和pBSK的酶切体系 充分混匀后 用离心机短时 10秒 离心 于37 保温3 4小时或过夜 65 保温10分钟
6、使限制性内切酶失活 五 注意事项酶的定义 在标准条件下 1小时完全消化1 g线型DNA分子所需的酶量定义为1U 影响限制性内切酶活性的生物因子 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质 识别序列在DNA中的分布频率 与DNA的构象有关 SC L OC DNA的纯度 蛋白 氯仿 SDS EDTA 甘油等 影响限制性内切酶活性的生物因子 内切酶用量不超过总反应体积的10 消化时间适当延长有利于提高酶活性 加DNAse free的BSA可以起到稳定酶活性的作用 用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活性 酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可使用 DNA样品应不含重金属离子 六 DNA片段的胶回收电泳洗
7、脱法低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法冻融回收法玻璃奶回收法柱回收法 按说明书进行 GelExtractionProtocol 胶回收后用30 50 l无菌双蒸水洗脱DNA片段 取1 5 l进行电泳检测 取2 5 l测定OD260nm下的光吸收值 计算DNA的浓度 注 1OD 260nm 相当于双链DNA浓度为50 g ml 七 胶回收注意事项将电泳槽用ddH2O反复清洗干净 倒入新鲜配制的灭菌电极缓冲液 根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板 切胶时尽可能切掉不含DNA片段的凝胶 要尽量减少DNA在紫外下的照射时间以减少对DNA的损伤 熔胶要完全 周四 熟悉实验原理及步骤 清洗三角瓶 量筒等器皿 装枪
8、头 1 5 0 5ml离心管 装牙签及配溶液等50 TAE 500ml0 5mol LEDTA pH8 0 500ml1mol LTris Cl pH8 0 500ml0 1mol LCaCl2 500mlddH2O 每组100ml5mol LNaOH 100ml配LB培养基液体 全班1000ml150ml 4瓶 Amp 用于两个质粒的接种100ml 4瓶 Amp 留做感受态细胞固体 含1 5 琼脂粉 每组100ml 共1200ml 可一起配再分装每组倒5个平板 Amp 用于次周转化灭菌 八 实验安排 周五 用Kit提取质粒DNA 倒琼脂糖凝胶板 1 进行琼脂糖凝胶电泳和浓度测定每人分别提取pGFPuv pBSK质粒各一管 每管60 l取1 2 l电泳 1 5 l用ddH2O稀释后在紫外分光光度计下测OD260及OD280 并计算浓度对质粒酶切过夜周六 酶切样品琼脂糖凝胶 1 电泳用Kit对酶切后的DNA pBSK大片段和GFP基因片段 片段进行胶回收每组用一个柱子回收电泳检测胶回收情况 用紫外检测回收DNA的浓度后 存放于 20 冰箱中 八 实验安排 续 九 DNA片段的连接 根据目的片段和载体大小 以等摩尔比 载体DNA 插入DNA片段 1 2 1 3 计算各自DNA加样量 连接体系 台式离心机离心10秒以混合均匀 16 连接4小时至过夜 连接产物存放于4 或直接转化细菌
