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1、化学发光免疫分析 陈仓医院检验科 一 化学发光免疫技术的概念二 化学发光免疫分析基本原理三 化学发光免疫分析的类型四 临床应用五 发展与展望 一 化学发光免疫技术的概念 化学发光免疫技术 化学发光分析是根据化学反应产生的辐射光的强度来确定物质含量的分析方法 化学发光免疫分析是将化学发光系统与免疫反应相结合 用化学发光相关的物质标记抗体或抗原 与待测的抗原或抗体反应后 经过分离游离态的化学发光标记物 加入化学发光系统的其它相关物产生化学发光 进行抗原或抗体的定量或定性检测 化学发光免疫分析 ChemiluminescenceImmunoassay CLIA 是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非
2、放射性免疫分析 它具有高灵敏度 检测范围宽 操作简便快速 标记物稳定性好 无污染 仪器简单经济等优点 它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析的取代者 是免疫分析重要的发展方向 CLIA发展迅猛 已占各种免疫分析的首位 是目前放射免疫分析和酶联免疫分析最佳的取代者 是目前世界公认先进的标记免疫测定技术 化学发光免疫分析技术具有高度的准确性和特异性 成为检验方法中最为重要的技术之一 化学发光免疫分析技术作为疾病诊断的主要手段已被广泛用于机体免疫功能 传染性疾病 内分泌功能 肿瘤标志物 性激素 甲状腺功能等方面的体外诊断实验中 化学发光免疫分析的优势 灵敏度高灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性 其灵
3、敏度可达10 22mol L RIA为10 12mol L 化学发光免疫分析能够检出放射免疫分析和酶联免疫分析等方法无法检出的物质 对疾病的早期诊断具有十分重要的意义 发光强度在4 6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系 这与显色的酶免疫分析吸光度 OD值 为2 0的范围相比 优势明显 虽然RIA也有较宽的线性动力学范围 但放射性限制了其应用 宽的线性动力学范围光信号持续时间长辉光型的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天 简化了实验操作及测量 绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂 或复合试剂 的一步模式 分析方法简便快速结果稳定 误差小样品系直接自己发光 不需要任何光源照射 免除了各
4、种可能因素 光源稳定性 光散射 光波选择器等 给分析带来的影响 使分析结果灵敏稳定可靠 安全性好及使用期长免除了使用放射性物质 到目前为止 还未发现其危害性 试剂稳定 保存期可达一年 二 化学发光免疫分析基本原理 化学发光免疫分析包含两个部分 即免疫反应系统和化学发光分析系统 免疫反应系统是将标记物质标记在抗原或抗体上 经过特异性免疫反应后 形成抗原2抗体复合物 然后进行对标记物进行检测 来测定待检物 化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化 形成一个激发态的中间体 当这种激发态中间体回到稳定的基态时 同时发射出光子 利用发光信号测量仪器光量子产率 化学发光免疫分析仪是通
5、过检测患者血清内待测物质从而对人体进行免疫分析的医学检验仪器 将定量的患者血清和辣根过氧化物 HRP 加入到固相包被有抗体的白色不透明微孔板中 血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结合物和固相载体上的抗体特异性结合 分离洗涤未反应的游离成分 然后 加入鲁米诺Luminol发光底液 利用化学反应释放的自由能激发中间体 从基态回到激发态 能量以光子的形式释放 此时 将微孔板置入分析仪内 通过仪器内部的三维传动系统 依次由光子计数器读出各孔的光子数 样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学模型进行定量分析 最后 打印数据报告 以辅助临床诊断 三 化学发光免疫分析的类型 化学发光免疫分析法根据其标记物的
6、不同可分为三大类 即化直接化学发光免疫分析 化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法 用吖啶酯直接标记抗体 抗原 与待测标本中相应的抗原 抗体 发生免疫反应后 形成固相包被抗体 待测抗原 吖啶酯标记抗体复合物 这时只需加入氧化剂 H2O2 和NaOH使成碱性环境 吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解 发光 由集光器和光电倍增管接收 记录单位时间内所产生的光子能 这部分光的积分与待测抗原的量成正比 可从标准曲线上计算出待测抗原的含量 3 1直接化学发光免疫分析 发光 Y Y Y 磁微粒 被测抗原 抗体 带吖啶酯标记物抗体 冲洗后 夹心法 1 加入H2O2 pH 10 2 加入碱 pH 10 直接化学
7、发光的机理 磁微粒模式图 Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 特点抗原和抗体结合与未结合部分的易分离 磁微粒技术 化学发光酶免疫分析 chemiluminescenceenzymeimmunoassay CLEIA 是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶 HRP 或碱性磷酸酶 ALP 来标记抗原或抗体 在与待测标本中相应的抗原 抗体 发生免疫反应后 形成固相包被抗体 待测抗原 酶标记抗体复合物 经洗涤后 加入底物 发光剂 酶催化和分解底物发光 由光量子阅读系统接收 光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大 再把它们传送至计算机数据处理系统 计算出测定物的浓度 3 2 化学
8、发光酶免疫分析 该分析系统采用辣根过氧化物酶 HRP 标记抗体 或抗原 在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后 形成固相包被抗体 待测抗原 酶 HRP 标记抗体复合物 这时加入鲁米诺发光剂 H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析 辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体 或抗原 在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后 形成固相包被抗体 待测抗原 酶标记抗体复合物 这时加入AMPPD发光剂 碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光 碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析 碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图 分
9、析步骤 电化学发光免疫分析 electrochemiluminescenceimmunoassay ECLIA 是以电化学发光剂三联吡啶钌标记抗体 抗原 以三丙胺 TPA 为电子供体 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光反应 它包括电化学和化学发光两个过程 3 3电化学发光免疫分析 在电化学发光免疫分析系统中 磁性微粒为固相载体包被抗体 抗原 用三联吡啶钌标记抗体 抗原 在反应体系内待测标本与相应的抗原 抗体 发生免疫反应后 形成磁性微粒包被抗体 待测抗原 三联吡啶钌标记抗体复合物 这时将上述复合物吸入流动室 同时引人TPA缓冲液 当磁性微粒流经电极表面时 被安装在电极下面的电磁铁吸引住 而
10、未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走 与此同时电极加压 启动电化学发光反应 使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移 产生电化学发光 光的强度与待测抗原的浓度成正比 电化学发光免疫分析示意图 电化学发光免疫测定示意图 标记磁颗粒在电场中发光工作示意图 目前我院最新引进的迈瑞CL 2000i全自动化学发光免疫分析系统主要以化学发光酶免疫分析为主 拥有国内完全自主知识产权 它的酶促化学发光是目前免疫诊断中最灵敏的化学发光体系之一 其核心性能达到了国际同类产品先进水平 该机采用高灵敏全球主流化学发光技术的CL 2000i分析系统 拥有业内领先的高效处理能力 可实现240T H检测 智能优化的测试流程
11、 专利逻辑设计 提升测试通量 瀑布式真空气吸清洗技术降样本携带干扰至最低 涵盖甲状腺功能 激素 肿瘤标志物 传染病等50多个检测项目 目前我科开展肿瘤标志物 甲状腺功能检测 生殖内分泌激素检查项目 后续依临床需要酌情开展新的项目 更好的服务临床 服务患者 四 临床应用 1 甲状腺激素2 生殖激素3 肾上腺 垂体激素4 贫血因子5 肿瘤标记物6 感染性疾病7 糖尿病8 心血管系统9 病毒标记物10 骨代谢11 过敏性疾病12 治疗药物监测 甲状腺功能检测项目及临床意义 甲功五项是T3 T4 FT3 FT4和TSH的总称 它与甲状腺功能有密切关系 是诊断甲亢 甲减的重要依据 检测甲状腺激素在甲亢和
12、甲减病人的诊断中已得到广泛应用 并成为判断疗效 监测复发的重要手段 甲状腺素 T4 甲状腺素 T4 是由甲状腺合成 分泌的激素 在调节机体代谢中起着重要作用 被分泌到血液循环中的T4能对垂体的促甲状腺激素 TSH 的调节起反应 下丘脑 甲状腺 垂体所组成负反馈机制对T4的分泌起着调节作用 在血循环中 T4约60 与甲状腺结合球蛋白 thyroxine bindingglobulin TBG 结合 30 与甲状腺激素转运蛋白 Transthyretin TBPA 结合 其余约10 与白蛋白结合 仅0 03 0 04 为游离状态游离的T4有活性 而结合的T4无活性 主要起备用作用 参考范围 5 0
13、 14 5ug dl CENTAUR 临床意义 T4升高 见于甲状腺功能亢进的病人 但轻型甲亢 早期甲亢 亚临床甲亢的变化未如T3明显 凡引起TBG升高的因素均可使T4升高 如妊娠 应用雌激素 葡萄胎 淋巴瘤 血卟啉病等 药物如胺碘酮 含碘造影剂 受体阻断剂 奋乃近 海洛因等T4降低 见于甲状腺功能减退的病人 轻型甲减 亚临床甲减的变化较T3明显 缺碘性甲状腺肿可见T4降低或在正常低限 而T3正常 肾病综合征 肝功能衰竭 遗传性TBG缺陷症 肢端肥大症 重症全身性疾病状态等 以及应用糖皮质激素 雄激素 生长激素 苯妥英钠等药物 血清中的三碘甲状腺原氨酸 T3 血清中的三碘甲状腺原氨酸 T3 仅
14、20 由甲状腺直接分泌而来 80 以上在外周组织通过T4脱碘而来 血液循环中的T3能对垂体的促甲状腺激素 TSH 的调节起反应 下丘脑 垂体 甲状腺所组成负反馈机制对T3的分泌起着调节作用 在血循环中 约99 5 的T3与TBG结合 但T3与TBG的亲和力明显低于T4 T3不与TBPA结合未结合的T3有活性 而结合的T3无活性 主要起备用作用 参考范围 0 58 1 62ug dL临床意义 T3升高 见于甲状腺功能亢进的病人 轻型甲亢 早期甲亢 亚临床甲亢的变化较T4明显 适合轻型甲亢 早期甲亢和亚临床甲亢以及甲亢治疗后复发的诊断 T3型甲亢仅有T3和FT3升高 与T4一样 T3亦受TBG变化
15、影响 但受影响程度不及T4 T3降低 仅于较重甲状腺功能减退的病人 T3和T4均下降 轻型甲减T3不一定下降 重症全身性疾病状态或慢性病变可导致T3下降 多见于慢性肾功能不全 慢性心功能不全 糖尿病 心梗等疾病的患者 游离甲状腺素 FT4 游离三碘甲状腺原氨酸 FT3 FT3和FT4分别为T3和T4在血清中未与蛋白结合的部分 其不受血清中TBG的影响 直接反映甲状腺功能的状态 其敏感性和特异性均高于T3和T4参考范围 FT3 2 3 4 0pg mLFT4 0 6 1 2ng dL 临床意义 血清FT3和FT4升高 甲亢 低T3综合征 由于5 脱碘酶受抑制 T4外周脱碘作用障碍使FT4升高 甲
16、状腺素不敏感综合征 FT3和FT4升高 而无甲亢表现 某些药物 胺碘酮 肝素等可使FT4升高 FT3适合于甲亢和左旋甲状腺素治疗中药物是否过量的判断 血清FT3和FT4降低 甲减病人两者皆下降 但轻型甲减 甲减初期多以FT4下降为主 低T3综合征仅有FT3下降 某些药物 如苯妥英钠 多巴胺 糖皮质激素也可使FT3和FT4降低 T3 T4均升高 高TBG血症 甲亢 甲状腺激素不敏感综合征 T4升高 T3正常或下降 家族性白蛋白异常性高T4血症 胰高血糖素瘤 药物普萘洛尔 胺碘酮 胆囊造影剂 全身性疾病 精神性疾病 苯丙胺成瘾 T4型甲亢 甲亢伴T4转换T3障碍 T4正常 T3升高 T3型甲亢 甲减用T3或者其他甲状腺激素制剂替代治疗后T4正常 T3下降 患有全身性疾病时 5 单脱碘酶活性下降 血皮质醇升高的各种情况 营养不良综合征 T4下降 T3升高 医源性甲亢 甲状腺功能正常病人服用甲状腺激素制剂 T4下降 T3正常 轻至中度甲减 碘缺乏 苯妥英钠 卡马西平 T3和T4均下降 中至重度甲减 重症全身性疾病 低TBG血症 大剂量使用水杨酸制剂 促甲状腺激素 TSH 促甲状腺激素是由 两亚
